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（木虫生物专题讨论）之核酸提取纯化专题贴
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———————————————————————————————— 继续招帖子工，招聘链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=910794&fpage=1 ——————————————————————————————————— 不才经过半个多月的整理，核酸提取纯化专题终于完成了。 本专题共分两篇 一为技巧篇 二为解惑篇 其中每篇分别整理成三章： DNA，RNA（含mRNA）和质粒。 请各位多多支持！ 如果你觉得你从中学到了一点东西， 就把它顶起来吧， 让更多的人从中获益~    [ Last edited by raindrop8316 on 2008-8-19 at 08:44 ] |
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 原创 | 关于RNA | 经验 | 音乐的梦 |
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I．技巧篇
2楼2008-08-15 17:13:35
3楼2008-08-15 17:15:07
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第三章 质粒提取与纯化 主题1：质粒DNA的分离纯化和鉴定 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=142066&fpage=418 发帖人：okaysee 主题2：一步法提取质粒DNA 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=202040&fpage=398 发帖人：aronxu 主题3：质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=417117&fpage=295 发帖人：raoqun20 主题4：质粒DNA提取试验常见问题解答 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=462010&fpage=270 发帖人：beingking 主题5：质粒DNA的分离、纯化和鉴定 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=543443&fpage=219 发帖人：lgj7966 主题6：转一篇关于质粒DNA提取原理的很棒的文章 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=772205&fpage=71 发帖人：wjswj 以下为付费下载部分 主题7：质粒DNA的提取及浓度检测 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=595213&fpage=189 发帖人：applepie119 主题8：质粒快速提取试剂盒 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=595209&fpage=189 发帖人：applepie119 主题9：质粒DNA的提取和纯化 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=102712&fpage=429 发帖人：pzhangyh 主题10：质粒提取简介及问题分析 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=666139&fpage=141 发帖人：yangym1123 |
4楼2008-08-15 17:17:49
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第四章 综合篇 主题1：核酸抽提（最糟糕篇） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=346409&fpage=320 发帖人：badger 主题2：核酸抽提原理 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=696113&fpage=127 发帖人： 静水深流106 以下为付费下载部分 主题3：核酸提取及常见问题分析 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=158181&fpage=411 发帖人：BEFOREBEYOND 主题4：DNA和RNA提取常见问题分析对策 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=253999&fpage=348 发帖人：czl-ee 主题5：关于真菌的DNA和RNA提取方法的总结 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=420752&fpage=293 发帖人：haixianggao 主题6：核酸提取常见问题分析 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=150148&fpage=275 发帖人：okaysee 主题7：核酸抽提 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=584493&fpage=196 发帖人：applepie119 [ Last edited by raindrop8316 on 2008-8-15 at 17:20 ] |
5楼2008-08-15 17:18:59
II．解惑篇
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第一章 DNA提取与纯化 主题1：蚌的基因组DNA提取问题（拖尾严重） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=888918&fpage=14 解答1：xyklmu 拖尾严重一般认为是所得的DNA有蛋白的污染，蛋白未抽提完全。 分子量大小小于1万bps，主要是酚氯仿抽提造成剪切所致。要想获得大分子量的genomic DNA，可以在蛋白酶K充分消化后，直接用异丙醇沉淀即可，不必经过酚氯仿抽提的步骤。这也得看你抽提DNA以后，用于什么目的了。如果仅仅是做pcr之类的，不必酚氯仿抽提。 主题2：DNA上样缓冲液各组分作用，原理 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=893542&fpage=15 解答1： 三磷酸腺苷 一般loadind buffer中的甘油、蔗糖都是辅助样品沉降的 因为样品太轻，在缓冲液中容易飘起来 所以需要一些重的东西包裹住，然后沉降下去 解答2：yujie8586 DNA用的6xloading buffer 含有色素溴酚蓝（Bromophenol Blue)、二甲苯腈蓝FF（Xylene Cyanol FF)，可以观察电泳的进行情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶（0.5% ~ 1.4%）中约与300 bp的双链线状DNA的迁移速度相同（在0.5×TBE中)，而二甲苯腈蓝FF则与4 kbp的双链线状DNA的迁移速度相等。溴酚蓝与二甲苯腈蓝FF在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率则随凝胶浓度的改变而不同。还有EDTA 和蔗醣。 解答3：xyklmu EDTA是DNAase的抑制剂，可以避免在电泳过程中DNAase的作用。 主题3：植物标本DNA提取，样品保鲜 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=882330&fpage=19 解答1：xueqiao1868 新鲜的最好,降解少! 怎么才能防止变焉???注意保水 采集时用冰袋,尽快提取 解答2：wyzl2007 最好的办法是将植物放入衣袋液氮罐中保存，只有有液氮就行 解答3：glenn_007 我的样品是采下来新鲜的叶片，用蒸馏水和乙醇擦拭表面清洁后，放入变色硅胶中快速干燥的。提取的效果挺好的。 或者用书压着效果也可以。 只要表面没有发黄，没有真菌和虫蛀，提取就没问题 解答4：xujian568 标本DNA的提取确实比较麻烦的，特别是老的标本，时间长了有时候就没有了，降解了，试试运气了，最好是用试剂盒。 保水的方法一般就是减少叶片的蒸腾，还有增加环境的湿度。 尽快提取。 解答5：ahhflhz 采集回来放-８０度冰箱保存就行了，没有超低温冰箱就放在-２０度冰箱， 采叶片的时候放在冰盒里或者液氮里就可以了 主题4：酒精浸泡的昆虫标本DNA 提取 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=884772&fpage=19 解答1：bioplant 乙醇具有沉淀DNA的作用，会不会提取时，沉淀的DNA在第一次裂解离心时丢弃啦。 常规试剂盒也是用普通试剂，所以有时自己配制的试剂因为新鲜，提取效果更好。 解答2： 三磷酸腺苷 估计是乙醇没有挥发干就拿去提 核酸纯化做得很好的公司是QIAGEN，要不你联系他们的技术支持看看有没有合适的试剂盒 主题5：DNA电泳(在100bp处有很宽，很亮的一堆东西，这是什么啊) 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=901836&fpage=1 解答1：11014612 是RNA 解答2：helenfang 在DNA提取过程中RNA很容易被降解，所以我想下面那些应该是降解的RNA碎片吧 解答3：snzydong 破碎的DNA片段 解答4：yelitao1983 我想应该是RNA而不是DNA破碎的小片段！本人提过N次植物基因组了！如果提取过程中DNA断裂的话，应该是一长串弥散的带，不应该只在100bp处有带！如果你非要弄明白是不是RNA，向提出的基因组DNA中加RNA酶再泡电泳验证一下就可以了！ 解答5：xiaochong0101 （楼主） 证实应该是RNA，因为加了RNA酶之后明显减少了 |
6楼2008-08-15 17:21:22
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第一章 DNA提取与纯化 主题6：酵母总DNA提取 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=908616&fpage=3 解答1：三磷酸腺苷 qiagen的核酸提取试剂盒一向都很好用 价格也不贵 解答2：aiai3252891 第一种方法，如果你扩增的片段不是很长的话，你可试试将培养的菌放入沸水中煮沸，然后离心。此方法的缺点是容易将总基因组切断，但是很方便。 二、用酶去细胞壁，然后用SDS,EDTA,乙醇抽提，这种方法非常经典，但是操作比较繁琐，但是提取的基因组非常纯净，而且条件温和，不易破坏基因组 主题7：生物活性炭中提取DNA 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=906449&fpage=4 解答1： 三磷酸腺苷 用PBS充分清洗样品，后高速离心（8000~10000rpm左右）把泥土和细胞一起离下去，弃上清，这一步是去掉细胞外的可溶性杂质。 用PBS重悬，然后低速离心把泥土离到管底，但不至于把细胞离下去，这个转速你就好好摸一下就可以了。离过头了就重新震荡混匀，降低转速再试试。然后取上清。 上清里头就含有细胞了，这时候就用经典的酚抽提法提DNA了 主题8：请教影响DNA降解的因素 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=310068&fpage=350 解答1：zhyl1984 酶，和DNA反复冻融 解答2：zw771113 刚提取出来的DNA用TE 溶解时间过长会不会使DNA降解? 不会，TE是金属离子鳌合剂，而核酸酶一般需要有金属离子存在才有活性。所以用TE溶解几个小时DNA都不会降解。 建议你冻存的时候分装保存，用的时候拿一份。就可以避免反复冻溶造成 DNA降解。 主题9：DNA电泳图分析 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=444161&fpage=277 解答1：ldxmhyq 曝光过度了吧。点样孔中有可能是没跑出来的样品，染色染的不好 解答2：xwluo 点样孔太亮,可能是蛋白未去得干净,你用酚、氯仿、异戊醇多抽提几次就可以了 解答3：michaelwuqingyu 蛋白没有去干净，蛋白带正电荷和核酸结合，导致ＤＮＡ在胶孔这跑不出去 解答4：phyllislhy 点样孔里的是蛋白质，RNA提的倒是不错建议你用CTAB法试一下，可能蛋白或糖等杂质比较多，没有提出来。 解答5：vivalk 可能是此生代谢产物较多，建议用经典的CTAB用尽量嫩的部位提取 解答6：天外飞天 RNA没除去,用RNAase消化一下 主题10：电泳图分析（条带不清晰） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=454851&fpage=275 解答1：Doublel 电泳时电压过高会导致电流强度增加，而电流的热效应是和电流的平方成正比的，电流强度过高会直接导致凝胶发热。凝胶发热使DNA分子热运动加剧，扩散速度加快，从而导致条带不清晰。 解答2：levixzhu 1 由于DNA分子量很大，一般建议用0.5-0.8%胶来电泳。PCR产物基本上可以根据分子量来决定胶浓度，一般用1-1.5%的胶浓度。所以建议，你用两块胶分别来跑DNA和PCR产物。 2 电泳电压对band的清晰度和分辨率是由影响的，电压的大小取决于你用的电泳槽正负极间的距离，一般是3-5V/cm。电压过高或过低，对band的清晰度和分辨率都是有影响的。 3 loading buffer的加量，要取决于你用的是几乘的loading buffer，如果是6Xloading buffer，loading buffer的量为你点样量的1/6，那么如果你点样5-6ul，加1ul loading buffer是可以的。如果用的是10Xloading buffer，loading buffer的量为你点样量的1/10，即如果你点样5ul，加0.5ul loading buffer就可以了。但是一般情况下，loading buffer量的多少对于条带的清晰与美观并无太大关系。 4 我们lab用的也是BIO-RAD的凝胶成像系统，说实话，你的条带是不太清晰。 建议A你用制胶的梳子时选择梳子空扁长的，那么条带会好看些。胶浓度也要相应调整。 B因为你的MARKER也不大漂亮，建议电压要优化些，电泳时间要视溴酚兰位于凝胶2/3位置时，可以停止电压。 C 还有你的电泳缓冲液，无论是TBE或是TAE，建议你换新的来电泳。一步步排除问题 |
7楼2008-08-15 17:23:50
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第一章 DNA提取与纯化 主题11：土样中DNA的提取 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=156607&fpage=271 解答1：annpc5 附件1：DNA recovery from soils of diverse composition 附件2：直接从土壤中提取DNA得方法 主题12：提取DNA时，PVP聚乙烯基吡咯烷酮的作用? 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=479437&fpage=258 解答1：发如雪 聚乙烯吡咯烷酮 分子式：(C6H9NO)n 一、性质： 粉末或水溶液，易溶于水及多种有机溶剂，具有良好溶解性，生物相溶性，生理惰性，成膜性，胶体保护能力和与多种有机、无机化合物复合的能力，对酸、盐及热较稳定。 二、用途： 在化妆品工业中作为分散剂、成膜剂、增稠剂、润滑剂及粘合剂，在医药工业中是药用合成新辅料之一，可用作片剂、颗粒的粘结剂、缓释剂。注射剂的助剂和稳定剂、胶囊的助流剂，液体制剂及着色剂的分散剂，酶及热敏药物的稳定剂，难溶药物的共沉淀剂，眼药的延效剂及润滑剂和包衣成膜剂等；在涂料、颜料、塑料树脂、玻璃纤维、油墨、粘合剂、净洗剂、摄影胶卷、压片、电视显像管、生产药水、胶布、消毒剂、纸张、纺织印染等方面用 作助剂。 解答2：anlewo7777 PVP可与多种物质，特别是含羟基、羧基、氨基及其他含活性氢的化合物或单质形成络合物，例如，它可与许多毒素、病毒、医药及毒性化学品形成络合物，以减少其毒性和刺激性。 与少数几种物质（如多元酚）的络合力很强，在中性及酸性物质中，形成沉淀。这种特性可从溶液和饮料中除去多元酚和花色素氰。但使用不溶性 PVP效果更好。 解答3：分子进化 主要是除多酚类物质 主题13：桃的DNA提取（果冻样沉淀） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=488559&fpage=253 解答1：lyl0807 加NaAc试试 解答2：tiny20022005 先用无CTAB的缓冲液洗涤匀浆能较好去除多糖 解答3：randomqd 把离心的速度调高些 解答4：hallhowe 离心后去掉异丙醇，再加入乙醇沉淀，再离心。离心要高速，4度 解答5：Doublel 杂质应该是树胶类物质，桃的果实中含量很多的。 主题14：请问怎样去除DNA提取产物中的色素等物质？ 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=499180&fpage=250 解答1：cdl007 你提的是DNA，可以用玻璃棒挑出来再溶到另一个管里 多漂洗几次，应该能去掉很多杂质 这个方法最简单而且不用引入新的污染 还可以采用非可溶性PVP（polyvinylpyrrolidone）研磨样品， PVP能络合多酚类物质，不但能较彻底防止氧化作用，而且能有效的去除多糖和色素，色素是PCR反应中的强抑制剂，一定要除掉 主题15：提取一种微型动物DNA 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=538532&fpage=223 解答1：xiaopu_yin 估计一些常规的方法你都试过，有没有想过在溶液中加几丁质酶，消化一部分虫体壁？ 解答2：glucidum 如果LZ只是需要提取一点点DNA 来做PCR,进行系统分析的话.建议试试在解剖镜下直接用镊子碾碎虫体然后加入蛋白酶消化处理。消化处理的溶液即可直接用做PCR,不需要再做沉淀处理等等。 解答3：陈硕真 超声破碎或高速球磨等机械方法肯定能够破碎，用研磨也可以 解答4：dajiahaoma Evaluation of extraction methods for the isolation of dust mites 7种提取方法 （附件下载） |
8楼2008-08-15 17:25:41
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第一章 DNA提取与纯化 主题16：植物线粒体DNA的提取 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=569136&fpage=206 无解答 主题17：CTAB法提DNA出现问题（碎末状沉淀） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=578068&fpage=195 解答1：guohuayin 我觉得碎末状沉淀是你没有去除干净的蛋白质，在苯酚－氯仿重提阶段，建议不要为了获取大量的的DNA而将中间的那层吸出来，那层是蛋白质，吸取上清液的时候，在最后快要吸完的时候，最好不要继续吸出了，防止蛋白质污染。建议你用苯酚－氯仿抽提一次，再用氯仿：异戊醇抽提一次。并且用70％的酒精多洗涤几次，酒精洗涤的作用主要是去除盐分。最后酒精洗涤完后，一定要晾干后再用适量的双蒸水溶解或者TE缓冲液溶解。 解答2：沙砾 建议大家在做DNA沉淀的时候加入1/10体积的3M的醋酸钠，再加无水乙醇，沉淀效果会更好 主题18：提取DNA检测发现三条带，谁能解释? 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=584447&fpage=195 解答1：tuotuozw 材料，过程都有可能造成DNA的怪异现象出现 解答2：xuuue 可能是连同RNA一起提了出来，这很正常，你去RNA了吗？ 解答3：如果泳道没有明显弥散现象，而且LZ电泳中出现的3条带中的2条挨得很进，且与第3条距离较远的话，那多数应该是xuuue所说的提取样品中混有RNA，加点RNaseA处理一下就可以了。 主题19：核酸提取求助:帮忙分析下失败原因在哪? 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=593897&fpage=188 解答1：guohuayin 抽提核酸中我的做法是 首先加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（体积比25：24：1），轻轻上下颠倒几次，混匀2分钟左右，12000rpm，离心10分钟； 然后吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比24:1)和上面的步骤一样，抽提一次，取上清 这两步试验可以反复三次，主要是去除蛋白质和糖类等杂质。 最后加入1/10体积的3M的醋酸钠（.PH5.3），2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。 －20度放置30分钟，室温15000rpm,离心10分钟，沉淀用70％的乙醇洗涤去除盐分，稍微干燥后，加入适量的缓冲液溶解。－20度冰箱中保存。 解答2：yangguoxing888 应该和上下颠倒的时间没关系。没准是你基因组提取后溶解，如果缓冲液多得话DNA浓度会低，这样也不一定能跑出来，至于前端的东西，没准是RNA。 解答3：tsguest 你上下颠倒混匀的时间太长了，这样容易把DNA弄断，而且如果你要是需要大片段的DNA，这样做更是不行。你如果把DNA一提出来，马上就跑，有可能就什么也跑不出来，你可以用TE溶了DNA后，在4度放置一晚，第二天再跑电泳就有可能有你提的DNA， 解答4：yzh-1999 说太剧烈导致链断裂，最后使得溶液浑浊这个说法太牵强。 我还是同意楼主说的，是消化不彻底的问题。我抽提RNA时，若样本太多，导致Trizol不够用的时候，也会出现大量的浑浊。我想可能是你没有加蛋白酶K，或量太少，导致蛋白消化不彻底，所以后续加酚不能使它沉淀分层。 冷冻后，这些悬在溶液中的蛋白析出，很正常。 所以，从消化开始，再注意点。 解答5：insect2004 你用的EB染色是不是浓度太低，或用的时间太长，把EB换成新的，另外加上MARK, 这样如果MARK跑出来而你的DNA没有跑出来，那就说明不是染色的问题，你再找别的原因，如果你不是用试剂盒提得，那你就检查一下你的关键试剂有没有问题，原因得一步步找，实验做得多了，你的经验也就多了，你再多提几次 解答6：yzh-1999 前面那些弥散条带可能是RNA，降解的DNA等等。 建议重新配制和准备试剂， 消化时间长一些，比如甚至可以将正在消化的样品在37度的摇床上过夜 解答6：insect2004 把样品保存在－80度，保存1－2年不会有问题，如果你们实验室没有超低温冰箱，那你就把样品保存在－20度，保存一两个月应该没有问题。关键试剂重新配，也不费多少事 主题20：求助DNA提取！ 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=597267&fpage=187 解答1：guohuayin 首先你先检测一下你的有没有提取出DNA，这个问题你可以先测定吸光度，同时也可以测定一下纯度，确定提取出来DNA后，再进行PCR扩增目的基因。扩增的时间一定要加入对照，看看PCR体系有没有问题。 解答2：自然风 你的试剂盒加酶之后处理的时间是不是比较短？因为试剂盒与常规提DNA的方法的差别之一就是试剂盒酶处理的时间要短得多，可能有这方面的原因。 另外，你的试剂盒是否是用柱子回收的？可以试试用常规的酚氯仿代替柱子回收看看，因为对于大片段的DNA，用柱子回收效果稍差。 还有，是不是因为样品的量比较少，才导致检测不清楚？ 解答3：bioartist 提取总DNA，破胞很关键！！ 上海生工的试剂盒都是用于一般菌体的提取，对胞外多糖多的细菌和革兰氏阳性菌，一般都比较难提取！ 另外，有时候，试剂盒提取的DNA量非常少，电泳检测不到，但可以用于PCR扩增目的基因，其他操作不宜！ 其实许多传统的方法提取效果都很好的！！ 解答4：xiaopu_yin 你抽提的是细菌、放线菌还是酵母？我用的是博达泰克的试剂盒，一般用液氮或在－80度反复冻融几次就会有较好的效果。总之破胞很重要，而菌体量过多有时效果反而不好。 |
9楼2008-08-15 17:27:11
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第一章 DNA提取与纯化 主题21：关于细菌DNA提取 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=613415&fpage=176 解答1：自然风 芽孢杆菌是阳性菌，溶菌酶终浓度一般需要3mg/ml，可能是你的对照菌株是阴性菌，所以效果较好。酶一般需要保存在—20度（还要避免反复冻融），4度保存很容易失活。 解答2：lingyu20071001 有的阳性菌较难破壁，可以把多加点溶菌酶，对基因组影响应该并不太大， 解答3：goses G+细胞壁都狂厚，代表菌就是金葡了，不过提DNA一般用不上溶菌酶。提质粒是必须用的，我加的5mg/ml，37度应该40-60m，每隔10分钟混悬一次。 溶菌酶最好是粉末存-20，现用现配，溶液存4度不能超过1周 主题22：洗涤DNA有什么技巧么? 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=605008&fpage=176 解答1：wujiequn 个人感觉先把70%的乙醇轻轻倒掉，但不要把EP管倒置于吸水纸上，剩余的一点溶液用小枪吸掉比较好，这时候自然晾干也比较快。 电吹风干燥一般没什么影响，有时候吹得太干了可能会把DNA也吹跑了。 解答2：xuuue 根据外观可以初步判断提取质量，好的DNA 沉淀为白色，干后透明；如果干后仍呈白色，常因蛋白较多；若呈黄至棕色，则是有多酚类杂质；呈胶冻状则含有多糖。 解答3：telomerase 乙醇是直接倒掉（绝大部分）,然后再离心然后用小枪吸净残留乙醇 这样的话很快就干了 ，没吹过电风扇 解答4：wujiequn 不要用吸水纸，太脏了，会污染。直接用小枪头吸出剩余的乙醇。沉淀贴壁牢不牢无所谓，吸的时候注意不要把沉淀吸出来就是了。 解答5：glucidum 一般情况下，用70%乙醇洗的时候DNA是会松动的，能松动是好事。去乙醇的方法像3楼说的那样就很好。至于吹干方面，一般基因组DNA不建议用吹风机吹干，一个是怕吹掉，另外一个原因是干燥过快会引起基因组DNA断裂。如果是 质粒提取的话，那吹干是没问题的。如果超净台比较空闲的话，吸掉乙醇以后放超净台吹干其实也蛮快的。 解答6：angelina-wl 先用70%乙醇洗，12000rpm,2min（可使DNA重新聚在管底）,重复一次，用无水乙醇洗一次（DNA干燥快一些），放在工作台上15~30Min风干即可。 主题23：基因组DNA检测问题 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=623067&fpage=170 解答1：niure 电泳有没看到比较亮的条带啊，有时候分光光度计结果也不要太相信，跑个PCR看下 解答2：xiaopu_yin 分光光度计检测时受洗脱所用的溶液有关，你可以试一下试剂盒提供的洗脱液和双蒸水，误差还是比较大的 解答3：yifanyifan 很多其他成分如糖类,蛋白也影响测定结果, 如果你有对照,比如公司合成的引物,可以测定一下,找找原因.不过大于2.0,理论上应该是RNA污染,你加些RNase 处理样品看看. 解答4：reasonspare 不知道楼主用的什么溶解的DNA，如果是试剂盒的，一半为Tris什么的，这时候浓度比较大一些。 如果你知道你用的试剂盒是什么东东，就更好了， 因为酚也影响，胍也影响。 还有，不要单单看比值，， OD230 和OD260， Od280的实际值 也不要太低 主题24：放线菌基因组DNA的提取方法 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=628829&fpage=162 (1〕取3ml培养过夜的细菌培养物离心0.5分钟，收集菌体； 〔2〕用无菌水洗涤菌体，12000rpm，离心1分钟； 〔3〕沉淀物加入567 u l TE（pH 8.0）缓冲液，重悬菌体，加入30 u l 溶菌酶（50mg/ml）混匀，于37℃温育1小时； 〔4〕加入30 u l 10%的SDS和3 u l （20mg/ml）的蛋白酶K，混匀，于55℃温育1小时； 〔5〕加入100 u l 5M Nacl, 充分混匀，再加入80 u l CTAB/Nacl 溶液，混匀，于65℃温育10min； 〔6〕 加入2ul RNA酶，37℃温浴15分钟； 〔7〕加入等体积的酚/氯仿，混匀，抽提； 〔8〕加入等体积的氯仿，抽提一次； 〔9〕 加入1/10体积的3mol/L NaAc 溶液，2倍体积的无水乙醇，混匀，放置－20℃冰箱30分钟； 〔10〕 轻轻混合直到DNA沉淀下来，离心； 〔11〕 用70%乙醇洗涤沉淀1次，晾干； 〔12〕将已干的DNA溶于40 u l 超纯水中，-20℃保存。 解答1：edragonfly 推荐看一本《链霉菌遗传操作手册》 建议修改： （2）用25mM的EDTA洗 （3）温育时间延长或增加溶菌酶量（貌似你的菌体不少啊） 如果多糖不是很厉害 第5步可以不要 整体步骤应该是没有问题的。 到（9）应该能看到明显的絮状沉淀 没有的话 基本就没提出来了 解答2：liudanlucky 加入溶菌酶温浴直到呈均匀粘稠状。纯度要求不是太高的话可以省去5，6步，4步中加入适量EDTA.第9步中直接用预冷的无水乙醇沉淀也可以。应该没问题，A260/A280可达到1.8-2.0 主题25：猪肝的DNA提取 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=638159&fpage=162 无解答 |
10楼2008-08-15 17:28:35
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第一章 DNA提取与纯化 主题26：提植物DNA时出现的问题（上清液墨绿色） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=639732&fpage=156 解答1：wenyangapple 我们实验室的protocol是这样的，你参考一下，看看能不能有所启发。 200微升CTAB研磨；加300微升CTAB; 65度水浴20分钟；加氯仿-异戊醇（24:1）震荡，离心，取上清；加等体积异丙醇，离心弃上清；洗涤，溶解。 我估计是你用的提取液不好了。 解答2：wdf1980122 转速不够 解答3：wdgsmv58 离心时间和转速不够 解答4：henghengyouyou 深绿色的溶液是对的，你还要其他几步在去除蛋白等 解答5：如来神掌 提取液加少了 解答6： glenn_007 加入提取液后，再用氯仿-异戊醇抽提2～3次去除蛋白干扰。每次缓慢颠转50次左右，然后离心，就可以得到上清液了。 主题27：细菌基因组DNA为什么提不出来？ 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=627321&fpage=155 解答1：reasonspare 如果出现多糖等物质需要洗涤几次，推荐TES， 其他可以用生理盐水或者灭菌去离子水， 1 ok 应该 2 加入TE后加入 lysome 37 度 1 h 或 更长时间，或者反复冻融（-20- 20度）超声波也可以考虑）总之先打破细胞壁。 加如 pro K 1h 去蛋白 3 加入 ＳＤＳ 后重复振荡，37 度 30min 或更长， 其他 不变， 解答2：hudong 请你检查一下你用的所有试剂，试剂出问题的话也是没有 DNA。如果是一点DNA都没有的话，那很可能是试剂出问题了。建议重换试剂试试，或同时用其它方法试试。还有，你是小提，不用摇那么多的菌，用试管摇5ml就够了。 解答3：fengkai6200 我是从肌肉组织提的dna。我加的SDS的量比你大，100ul10%SDS。在55度反应2小时。当然因为肌肉组织不好裂解，所以比提菌的DNA多加了SDS，提高了反应温度。 我觉得你可以适当的改变一下条件，加大点SDS的量，或延长反应的时间。 我这方法提取的DNA质量很好的，没有降解，做pcr的效果也很好的 解答4：li3564617 dna沉淀使用肉眼看不见的，你不妨提完后跑个电泳看看，上述方法应该没问题，我用上海生工的试剂盒用的方法根你的差不多，效果也不错。 我们用无水乙醇沉淀，加入等体积的无水乙醇，-20摄氏度放置10分钟，然后4度离心 解答5： edragonfly ctab和DNA在低浓度Na离子时会发生结合 具体浓度是多少不记得了 自己查一下 解答6：genehsy 第六步中可以加1/10体积的3mol/L的醋酸钠促进DNA沉淀。 另外还有一种简单的方法你可以试一试，收集菌体用TE悬浮后直接用等体积的苯酚：氯仿（1：1）混合液直接抽提，离心取上清液，醇沉即可。 解答7：wbz66 DNA提取之后是看不见的,能看见的是一些蛋白质的杂质,建议跑个电泳看一下最好 解答8：bbzhangzhang 一个超级高手经常提醒我，抽提，一定首先把菌或细胞器充分裂解！ 我个人强烈建议你在适当的裂解步骤加上剧烈涡旋2min，其他步骤暂时不变，相信会有作用。另外我查了，“CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可以从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA ”。你看盐离子浓度是否合乎CTAB结合与分离核酸的要求，再做调整 主题28：花生DNA提取出现的问题 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=645796&fpage=153 解答1：deepbluewater 你换SDS法试试？或者用液氮法？其实CTAB法除多糖的效果较好，但是对样品要做些前处理，我作的样品在CTAB之前需要用乙醇溶液浸泡，你可以试试对样品进行前处理（例如乙醇溶液浸泡，PVP浸泡【但是PVP浸泡容易导致DNA浓度过低，琼脂糖凝胶检测时条带不明显】） 解答2：glenn_007 离心后，取上清电泳试试？我觉得你应该是提取到了 SDS法适合蛋白含量较高的样品，CTAB适合多糖成分含量较高的样品。视具体情况而定 主题29：细菌基因组DNA抽提的问题（多条带） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=662031&fpage=139 无解答 主题30：氧颗粒污泥总DNA提取（附电泳图） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=675053&fpage=138 解答1：xiaoyu1014126 你把土样都放冰箱里，有些能产芽孢的菌都产生芽孢，这对实验啊有影响啊？ 解答2：lxlxyc CTAB/NaCL在温度低的情况下结晶，放在65摄氏度水浴，直到结晶彻底溶解。水浴时不停摇动。 |
11楼2008-08-15 17:29:48
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第一章 DNA提取与纯化 主题31： DNA提取电泳图分析（拖尾，点样孔亮） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=695090&fpage=127 解答1：marongfeng 点样孔处比较亮，可能就是多糖比较多。拖尾的话可能是轻微的讲解吧。至于做杂交就不知道可不可以了。如果做测序肯定要纯化。 解答2：fw1980613 点样孔的是杂质，提取用的样品最好用鲜样。 最好别用做杂交。 杂交选择质量好的DNA。 解答3：JayKing999 点样孔有亮度应该是实验操作的问题。电泳时尽量小心的将将枪头深入点样孔后再打出，DNA放置时间长有降解对杂交应该没太大的问题。我们实验室有用了半年的DNA做PCR、杂交都没问题。 主题32：DNA提取问题（酚仿抽提后离心总是出现混浊，离不下去） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=399218&fpage=127 解答1：浪迹天涯 可能是你的样品混有其他杂质。 解答2：eleenjane 试剂的问题？ 解答3：heda0691 把转速提高些试试（10000-12000rpm，10min），好象有点效果。 解答4：suneternal 我觉得可能是中间乳化剂的问题，另外可能是温度比较低。 我也经常提出DNA，是从动物组织中。开始的时候也出过一些问题，但我尽量能把每一步做到标准化，现在是基本没出过问题了。 我觉得你加入样品多少（磨完后在加CTAB前称一下样品），加多少CTAB，再加多少酚氯仿，最好都有一个比例。这样做虽然有点繁琐，但我觉得中间出了问题也好知道在哪里。 解答5：yaoqian622 在材料研磨时要注意材料量，尽量作到研磨成粉状，用1.5ml离心管装时液氮粉的量不要超过0.5ml的线，建议多次离心抽提，适量提高转速，但也不要过高。 主题33：大曲中微生物DNA的提取方法 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=888791&fpage=23 无解答 主题34：关于HBV DNA提取 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=829660&fpage=53 解答1：wjswj 经典的核酸提取方法通常是加去污剂（SDS等）裂解细胞，经蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。（全部解答见链接）。 主题35：请教热裂解法提取细胞DNA（在50个细胞中得到基因组DNA） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=845366&fpage=45 无解答 |
12楼2008-08-15 17:30:31
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第二章 RNA提取与纯化 主题1：RNA电泳只有5S 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=910041&fpage=2 解答1：jasco 降解 解答2：raindrop8316 降解了；时间跑长了（5s和18s都跑出去了，就剩28s了） 主题2：哪位用TRIzol法提过樱花的总RNA? 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=481566&fpage=259 解答1：johnsooh 如果你是平行作的烟草、番茄可以提的出来，而樱花、樱桃、桃子提不出来，那么可能要求更改针对特殊植物样本的提取方法了，可是，如果不是平行操作，平行电泳检测，则不能说明方法有问题，建议重新作 解答2：telomerase 从富含多糖的植物组织中提取和纯化RNA （方法详见链接 8楼） 主题3：SDS/酚法提植物RNA 为什么沉淀不是白色 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=595187&fpage=188 解答1：reasonspare 没有关系， 你比如说提取的是植物叶片或茎， 无论你研磨多小， 都会有些色素干扰，所以 操作的质量好不好，关键看结果，如果结果不好： 如果是降解了，那就从防止RNase 入手，如果提到的量少，或者有DNA 或蛋白的污染， 就要从操作上改进，具体怎么改进，我觉得这个方法很成熟，只有工作做到位，肯定能出来。。。。。。 解答2：guohuayin 你提取的RNA中有色素，也就是说你在吸取上清的时候，尽量少吸些，宁缺勿滥，只要提取的RNA质量好，肯定能反转录出来，我试过，我提取的RNA也含有色素，但是RNA质量好，也反转录出来了 主题4：RNA提取OD260/280>4.0? 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=504545&fpage=246 解答1：轻5飞扬 有没可能是你提的不错,但跑电泳时上样太高,以致看到拖影,至于OD值么,呵呵,我觉得一般来讲都不是很准,当然4可能确实有些太过了,呵呵,你做什么呀,如果要求一严格的话,直接RT一下,有你要的东西不就OK了么 解答2：yang22181 拖影应该是降解的结果吧！? OD值的比值肯定错误！检查你的分光光度计（找个已知浓度溶液）和比色杯（应用配套石英杯）！ 解答3：lanyu270 降解了，肯定>2.2为降解。 解答4：fruit 有不同的溶液OD值是不同的，用DEPC水可能会偏低，有tris可能会偏高，用蒸馏水试试。 主题5：花的RNA提取问题 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=518971&fpage=208 解答1：puma2003 是不是花中的本来含量就少啊 解答2：wpszy2000 短链的RNA用这种方法不行的，要用超离心法！ 解答3：hn8265 花的含水量如果高的话，在提取的时候很易被降解。你可以试试少放些样品，或多加些Tirzol. 解答4：鲸鱼001 试试其他方法，用LiCL沉淀法看看，能不能行，还有你的花最好不要带露水。 氯化锂沉淀法很容易可以搜到。 |
13楼2008-08-15 17:31:25
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????? RNA??????? ????6?????RNA extraction????????? ?????http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=574242&fpage=203 ???? ????7???????????????????RNA?????? ?????http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=613045&fpage=170 ???1??xyzwujun RNA??????????????????????????????????? ???2??telomerase ????????????????????Э????????????????????????????????? ??????-80??????????????????????????????????????????????? ???3????? ??????????????????????-50??????6????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????У????????????????????? ???4??kklkimo 1. ??B???????z?w????B??(-196 C; ?^Σ?U)?????(-45C; ?^???) ????o??????n????????????????M?????(?????????)??????????Tri-reagent or Trizol ??4C????????????????? 2. ?z?w???L?????F????RNA Later (Qiagene or Sigma) reagnet ?????á??????m??reagent ?????oRNA????????Ч??????e??????豣????-80C???? ????8?????RNA????? ?????http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=668040&fpage=142 ???1??hyf9901 ????????07???????????????????????????????RNA??? ???2??xiding Wan CY, Wilkins TA (1994) A modified hot borate method significantly enhances the yield of high-quality RNA from cotton (Gossypium hirsutum L.). Anal Biochem. 223: 7?C12 ????9??23S rRNA??????? ?????http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=726982&fpage=104 ???? ????10?????RNA??? ?????http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=920650&fpage=1 ???1????? invitrogen????????????trizol,Ч??????????????????????????????Ч??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????trizol????????????????????????????????????????????????м??????????????????????????rna?ǹ??????С???????????????????RNA??????????????漸??????????????У???????trizol???????????depc?????????????? |
14楼2008-08-15 17:32:32
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第二章 RNA提取与纯化 主题11：提RNA后测得OD值比为2.3,电泳什么都没有 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=759097&fpage=95 解答1：轻5飞扬 如果提出来了,那么无论你如何电泳,只要没有上RNase消化,至失会有一条非常亮的5S表明的你RNA降解了,如果你什么也没看到,那可能你什么也没提出来,不知道沉淀完后能看到EP管中有白色沉淀么? 主题12：mRNA 分离纯化后，电泳是2条带，没有smear. 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=776594&fpage=81 无解答 主题13：RNA提取（在涡旋器上涡旋会不会震断RNA） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=860874&fpage=38 解答1：raindrop8316 我们原来用LiCl法（不是试剂盒)提真菌的RNA，也是要求加完裂解液后在涡旋器上涡旋，提出来的效果也蛮好的，断了没有我就不知道了，我们只是用来做简单的RT-PCR，能做出来就是了 |
15楼2008-08-15 17:33:39
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第三章 质粒提取与纯化 主题1：提取质粒时为什么总是有总DNA？ 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=617672&fpage=175 解答1：jiasanlin 如果是碱裂解发提取质粒的时候，一般裂解时间长的化就会混入genome DNA,一般情况下加入溶液2后只要看到菌液清亮，就要马上加入溶液3 终止。变清亮的时间跟收集菌体的量和溶液2的用量有关，分子克隆手册上的不要超过5分钟，只是一个大概的时间。 解答2：guohuayin 前三步越快越好，并且动作一定要轻柔，不然会造成大量的基因组DNA断裂。 解答3：angelina-wl 加溶液2后动作要轻柔,也要快.不然会打断总DNA,在电泳检测时在靠近口的地方就能看见. 解答4： 随风而过 实在没办法，你就跑个电泳切胶回收质粒，质粒的分子量你应该知道吧。提取质粒的时候加容易2的时候要轻柔，最好只是轻轻的颠倒几次就行，千万不要用涡旋混匀器，否则动作大了就会打断总DNA的 主题2：如何抽提较大的质粒 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=400060&fpage=160 解答1：wwwkkk83 超纯度大型质粒的抽提试剂盒 专门用于纯化小于250kb的BAC、PAC、P1或粘粒DNA，可彻底去除基因组DNA的污染。 货名 规格 货号 价格 QIAGEN large-Construct Kit 10perps 12462 4338 解答2：轻5飞扬 质粒大,所以拷贝会少自然提出的也少,用碱法提应该可以,多集些菌,然后蛋白那部多抽些应该会好些,最后消化时间也略长些吧,2h可以试一下 解答3： 随风而逝 减法抽提的量确实比较大，我们实验室都是用这种方法抽30000左右的大质粒的。你的量比较少可能有以下几个问题： 1. 大质粒不能保菌，每次都要转化质粒，调斑。剩余的部分菌液，赶在第二天前大扩。千分之一加菌液，青霉素千分之一稍小些。 2. 摇菌时间保证十二小时，时间稍长，大质粒会迅速消失 主题3:如果提取这种菌的质粒和RNA (洋葱伯克氏菌，G- 细菌) 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=725282&fpage=115 无解答 主题4：质粒提取结果两条带是为什么（疑为基因组DNA） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=767741&fpage=87 解答1：lauren180 延长碱变性时间 解答2：yuanzhiqin.119 试试在提取液上想想办法，本质跟延长时间是一样的 解答3：linfeng196 我觉得有三种可能，一是细菌基因组的污染，解决的办法是加入溶液II的时候操作要轻柔，不要剧烈，还要控制时间，二可能是你的质粒的状态不好，如果你的质粒状态好的话，大多数应该以超螺旋形式存在，而你的都是线性的，没有超螺旋的，所以那个可能是开环状态的质粒，我觉得第二种可能性更大些 。第三种可能是已经发生了质粒的整合 主题5：质粒电泳求助（没有条带) 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=780570&fpage=79 解答1：xxh8372 是不是上样有些少啊？ 解答2： 十比 应该以电泳为准，分光光度计不准的。可能质粒提得有问题 主题5：质粒提不出来？ （保存的菌种在AMP中可见长，但质粒提不出） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=876309&fpage=30 解答1：jasco 菌液划线，挑单菌落，再液体培养重新抽质粒 解答2：duanyongzhong 可能是你的菌种已经被污染了，在这种情况下，菌体内含有amp抗性基因，但并没有质粒的存在，所以你提不到质粒，我考虑是这种原因。检验你的受体菌是否被污染。 [ Last edited by raindrop8316 on 2008-8-19 at 08:47 ] |
16楼2008-08-15 17:34:06
17楼2008-08-15 17:35:56
18楼2008-08-16 09:47:01
19楼2008-08-23 18:58:49
20楼2008-08-24 10:43:02
21楼2008-08-25 08:36:15
22楼2008-08-25 09:01:53
23楼2008-08-25 11:17:25
24楼2008-08-25 16:32:48
25楼2008-08-25 17:08:12
26楼2008-08-26 09:31:22
28楼2008-09-11 10:53:40
29楼2008-09-15 18:27:29
30楼2008-09-16 07:17:30
31楼2008-09-18 07:33:13
32楼2008-09-18 07:37:00
33楼2008-09-18 09:00:08
34楼2008-10-06 15:18:38
学习 整理的好详细啊35楼2008-10-12 00:58:32
36楼2008-10-16 08:12:54
37楼2008-10-25 14:14:20
38楼2008-11-08 20:17:04
39楼2009-02-14 16:25:44
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qiaofen27楼
2008-08-26 10:52
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