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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 电泳图谱咋这个样子，求助啊！
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bio830805

银虫 (小有名气)

[交流] 电泳图谱咋这个样子，求助啊！

发觉自己的DNA电泳谱图老是很分得不好，有时候有很严重的拖尾现象。上次看到楼上实验室的师姐做得就非常清晰，每个band都分得很开，而且没有拖尾。我一般做电泳的条件是：
1.电压为80mV，
2.电泳时间一般为25－30min
3.一般吸取5ul待测DNA悬液，加到1ul loading buffer上混匀，然后加入well.
感觉条带总是不好，用的是Bio-rad的凝胶成像仪。
我最近做的一张图谱再附件里。

想请问各位前辈：
1.电泳电压对band的清晰度和分辨率影响有多大？
2.loading buffer的加量要遵守什么哪些条件，是不是有比例的？
3.怎么才能让电泳图看上去好些呢？
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1楼 2007-04-21 10:12:57
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asr

荣誉版主 (知名作家)
★
dfggc(金币+1):多谢交流
4.10-4.12
泳道
名称
1
Mark
2
Quantitive mark
3
DNA (diluted 12-fold)
4
DNA (diluted 11-fold)
5
Mark
6
PCR product 1
7
PCR product 2

PCR process:
94℃ for 4 min
94℃ for 1 min
52℃ for 45s
72℃ for 2 min
Go to 2 for 29 times
72℃ for 10 min
4℃ for ever

1                 7
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思想极度邪恶，勿怕勿怪！\(^o^)/~
2楼2007-04-21 11:12:49
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Doublel

铁虫 (小有名气)
★
dfggc(金币+1):多谢交流
电泳时电压过高会导致电流强度增加，而电流的热效应是和电流的平方成正比的，电流强度过高会直接导致凝胶发热。凝胶发热使DNA分子热运动加剧，扩散速度加快，从而导致条带不清晰。
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3楼2007-04-21 11:15:28
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lys6827

木虫 (著名写手)
★
dfggc(金币+1):多谢交流
如果你做PCR产物检测，建议取2ul的产物与2ul的loading buffer混合后点于1%胶以120伏电压电泳。如果是总DNA检测取1ul与2ulloading混合，胶用0.5%到1%以50伏电压电泳。回收胶则用2%，电压50-100伏，将3ul的loading 加到所用产物中混合后上样。
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4楼2007-04-21 11:55:08
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levixzhu

木虫 (正式写手)
★ ★
dfggc(金币+2):多谢交流
1 由于DNA分子量很大，一般建议用0.5-0.8%胶来电泳。PCR产物基本上可以根据分子量来决定胶浓度，一般用1-1.5%的胶浓度。所以建议，你用两块胶分别来跑DNA和PCR产物。
2 电泳电压对band的清晰度和分辨率是由影响的，电压的大小取决于你用的电泳槽正负极间的距离，一般是3-5V/cm。电压过高或过低，对band的清晰度和分辨率都是有影响的。
3 loading buffer的加量，要取决于你用的是几乘的loading buffer，如果是6Xloading buffer，loading buffer的量为你点样量的1/6，那么如果你点样5-6ul，加1ul loading buffer是可以的。如果用的是10Xloading buffer，loading buffer的量为你点样量的1/10，即如果你点样5ul，加0.5ul loading buffer就可以了。但是一般情况下，loading buffer量的多少对于条带的清晰与美观并无太大关系。
4 我们lab用的也是BIO-RAD的凝胶成像系统，说实话，你的条带是不太清晰。
建议A你用制胶的梳子时选择梳子空扁长的，那么条带会好看些。胶浓度也要相应调整。
B因为你的MARKER也不大漂亮，建议电压要优化些，电泳时间要视溴酚兰位于凝胶2/3位置时，可以停止电压。
C 还有你的电泳缓冲液，无论是TBE或是TAE，建议你换新的来电泳。一步步排除问题。
最后，祝你好运！呵呵
赞一下(5人) 回复此楼
加油！
5楼2007-04-21 12:39:07
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levixzhu

木虫 (正式写手)
1 由于DNA分子量很大，一般建议用0.5-0.8%胶来电泳。PCR产物基本上可以根据分子量来决定胶浓度，一般用1-1.5%的胶浓度。所以建议，你用两块胶分别来跑DNA和PCR产物。
2 电泳电压对band的清晰度和分辨率是由影响的，电压的大小取决于你用的电泳槽正负极间的距离，一般是3-5V/cm。电压过高或过低，对band的清晰度和分辨率都是有影响的。
3 loading buffer的加量，要取决于你用的是几乘的loading buffer，如果是6Xloading buffer，loading buffer的量为你点样量的1/6，那么如果你点样5-6ul，加1ul loading buffer是可以的。如果用的是10Xloading buffer，loading buffer的量为你点样量的1/10，即如果你点样5ul，加0.5ul loading buffer就可以了。但是一般情况下，loading buffer量的多少对于条带的清晰与美观并无太大关系。
4 我们lab用的也是BIO-RAD的凝胶成像系统，说实话，你的条带是不太清晰。
建议A你用制胶的梳子时选择梳子空扁长的，那么条带会好看些。胶浓度也要相应调整。
B因为你的MARKER也不大漂亮，建议电压要优化些，电泳时间要视溴酚兰位于凝胶2/3位置时，可以停止电压。
C 还有你的电泳缓冲液，无论是TBE或是TAE，建议你换新的来电泳。一步步排除问题。
最后，祝你好运！呵呵
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加油！
6楼2007-04-21 12:41:39
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Doublel

铁虫 (小有名气)
★
asr(金币+1):估计是打错了,呵呵
"电压为80mV"是不是有什么问题啊？应该是80V吧？
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7楼2007-04-21 18:49:17
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轻5飞扬

金虫 (正式写手)
★
asr(金币+1):Thanks!
个人感觉是胶做的有问题,楼主用多大浓度的胶呀?你还是确定一下5V/cm的好
不过好像有时和你用的agarose有关,你们用的什么样的,是国产的么,我记得有一种很老式的,超难用,呵呵,所以用适当的试剂也有关

[ Last edited by 轻5飞扬 on 2007-4-21 at 20:31 ]
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8楼2007-04-21 20:29:09
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randomqd

木虫 (小有名气)

樱花骑士

平时我都是用65V跑的

最高我也只是70V,咱其它的没有,只有时间...
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未来天空才是极限
9楼2007-04-22 00:52:41
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bio830805

银虫 (小有名气)
太感谢大家了，向前辈们致敬！
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不会跳舞的外语达人不是好生物学家
10楼2007-04-22 17:22:58
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