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质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳
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（一）碱变性法提取质粒DNA 质粒(Plasmid) 是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA。带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。将质粒指纹图谱分析方法、质粒DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。 分离和纯化质粒DNA的方法很多,但这些方法基本包括三个步骤：即细菌的培养和质粒DNA的扩增，细菌菌体的裂解; 质粒DNA的提取与纯化。 本实验学习用碱变性方法提取质粒DNA。 【原理】 细菌培养物加入SDS和NaOH 碱性溶液处理后，菌体裂解，可使细菌的质粒DNA、染色体DNA和RNA一起从细胞内释放出来，经琼脂糖凝胶电泳，因各种核酸分子的迁移率不同将上述核酸分成不同的带。用溴化乙锭（EB）染色后，在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光。根据荧光的位置，可区分不同的核酸带。 【材料】 1．菌株 E.coli JM109（pUC19），E.coli RRI（pBR322） 2．试剂 溶液Ⅰ( 50 mM葡萄糖, 25 mM Tris.Hcl PH 8.0, 10 mM EDTA) 溶液 II ( 0.2 N NaOH，1%SDS) 用前新配制 溶液III ( 5 mM KAc溶液PH4.8) TE缓冲液 (10mMTris.Hcl ,1mMEDTA PH8.0) LB液体培养基( 胰蛋白胨 10g,，酵母粉5g, Nacl 10g. 加蒸馏水溶解，用NaOH调PH 至7.5，加水至1000 ml,15磅高压灭菌15分钟)。 【方法】 1．接种细菌于5ml LB液体培养基中，370C培养过夜。 2．3000 rpm/min,离心15min，弃上清。加入100ul 溶液1悬起细菌沉淀。 3．加入200ul前新配制的溶液II ，颠倒EP管5次混合均匀，置冰浴2min。 4．加入150ul溶液III温和地混匀，12000 rpm/min,离心5min。 5．吸取上清清亮裂解液放入另一新EP 管中，加等体积酚-氯仿-异戊醇抽提2次，12000 rpm/min,离心2min。（若不做酶切，此步可省略）吸取上清放入另一新EP 管中，加入二倍体积的冷乙醇，12000 rpm/min,离心10min。 6．弃乙醇，干燥后用30ul TE缓冲液洗下核酸，待电泳检测。 （二）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳技术（Agarose gel electroghoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。 【材料】 1．琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液（40m MTris ,20 mM NaAc,1mM EDTA PH8.0） 2．载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）、溴化乙锭水溶液（10mg/ml ） 3．凝胶槽、电泳仪 【方法】 1．取琼脂糖0.9g，加入100ml 1x TAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，1000C加热溶解。 2．平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5~1mm）。 3．铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml 的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至500C左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm。 4．待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm，小心拔出梳子。 5．DNA 样品与载体缓冲液5：1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。 6．打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm。 7．据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5s RNA和0.3 kb DNA 带之间）。 8．电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。 |
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