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zuolili213铁杆木虫 (正式写手)
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总RNA的提取
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Trizol使用说明书 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA 质量的高低常 常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot 等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总 RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。 二、用户需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf 管（RNase-free）、 ips （RNase-free） 三、准备工作 RNase 酶非常稳定，是导致RNA 降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失 活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是 RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验 时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处 理。一般情况下采用用DEPC 配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。 取RNase-free的物品时必须戴手套。 1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品， 如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。 处理步骤如下： 1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC 使DEPC 的终浓度为0.1%。注意：DEPC 为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。 2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC 水溶液，使塑料制品 的所有部分都浸泡到溶液中。 3）在通风柜中室温处理过夜。 4）将DEPC 水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC 水处理过的塑料制品的 烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30 分钟。 5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 2、 璃玻和金属物品 250°C烘烤3 小时以上。 四、从组织中提取总RNA 1) 液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少 量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol 加入Trizol，转入离心管进行 第2 步操作。 2) 匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外，组织体积不能超过Trizol 体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。 五、从细胞中提取总RNA 1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml 比例加入。 2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106 动物、植物或酵母细胞，或 107 细菌细胞。 六、操作步骤 1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期 保持。 2、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。 3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器， 以免基因组DNA断裂。 4、4℃ 12,000g 离心15min。 5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和 蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。 6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。 7、4℃ 12,000g 离心10min，弃上清，RNA沉于管底。 8、按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。 9、 4 ℃ 8,000g 离心5min，尽量弃上清。 10、室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。 11、可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。注：H2O、 TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。 12、测O.D值定量RNA浓度。注：此方法提取RNA A260/A280 值在1.6-1.8之间；产 率估计：组织标本：（ug RNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ug RNA/106 Cell）：5-15ug。注： 组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol 用量；组织或细胞用量过多，会引起DNA 对RNA 的污染；高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后 须4℃ 12,000g 离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉； 热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源；组织块用液氮研磨，效果最好， 若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀 将组织碱碱剪碎，然后再充分研磨。 [search]RNA[/search] |
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