| 查看: 1014 | 回复: 0 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
liyuanzhang007金虫 (正式写手)
|
[交流]
【实验】特殊组织DNA的提取及鉴定
|
||
|
特殊组织DNA的提取及鉴定 1、提取DNA的简易方法: 1)、从全血中提取DNA：取20μl抗凝血于0.5ml无菌管中，加500μl左右的ddH2O混匀后，12000rpm离心2分钟，弃上清，（若沉淀中仍 有红细胞,需重复此操作1-2次）加入样品提取液20μl,混匀,100℃煮10分钟(可在扩增仪上进行)后12000rpm离心5分钟,取上清2μl进行扩增。 2)、从其它有核细胞中提取DNA：可直接加适量的样品提取液到装有发根、头屑、骨髓、精子、组织碎片等有核细胞的管中,100℃煮10分钟（可在扩增仪上进行）后12000rpm离心5分钟，取上清进行扩增。 2、从全血中用有机溶剂提取DNA： 1）试剂 a.10%SDS b.2.0M醋酸钠 c.20mg/ml蛋白酶K d.苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1) e.分析纯乙醇 f.TE(10mM Tris,1.0mMEDTA溶液,Ph7.5) 2）步骤 A、血液样本收集于含EDTA的抽血用管子中，样品用手倒转试管混合后等分。每份700μl全血可放在1.5ml的塑料离心管中，-70℃储存。 B、在解冻的（或液体的）血液中加入800μl的TE并混匀，12000rpm离心2分钟。 C、吸取1.0ml上清液并弃去。 D、加入1.0mlTE,振荡后离心2分钟,去除尽可能多的上清液,但不要影响沉淀。 E、向沉淀中加入：375μl 2M醋酸钠; 25μl 10%SDS;5μl 蛋白酶K溶液。略加振荡，于56℃保温一小时。 F、加入120μl苯酚/氯仿/异戊醇，振荡30秒。 G、12000rpm离心5分钟。 H、小心移出水相（上层）到一新的1.5ml的离心管中。 I、向水相中加入2.5倍体积预冷的分析纯乙醇，倒转试管加以混合，将试管于-20℃下放置10分钟以上。 J、12000rpm离心10分钟。 K、倾去酒精，用移液器小心吸去剩余酒精，不要触动沉淀。 L、加180μl TE 后振荡。加20μl2M醋酸盐，手工混匀。 M、加500μl预冷分析纯酒精，用手轻轻混匀，12000rpm离心10分钟，倾去上清液。 N、用室温下的70%酒精1ml洗涤DNA沉淀,12000rpm离心5分钟，倾去上清液。 O、用移液器吸去残余的酒精，管子置于真空离心抽除残余的酒精（大约10分钟）。或将管子放在100℃以下烘干。 P、加200μl TE于DNA沉淀中，混匀后于4℃保温过夜（或56℃溶解DNA 2小时以上），次日清晨振荡10秒。 3、从斑痕材料中用有机溶剂提取DNA 1)试剂 a.斑痕抽提缓冲液（1.21g Tris,5.84gNaCl,6.02g二硫苏糖醇， 2%SDS,10mMEDTA/升,Ph8.0） b.其它试剂见2.1) 2)步骤 A、将斑痕剪成碎片后置于1.5ml的塑料离心管中。 B、加400μl斑痕抽提缓冲液及10μl蛋白酶K溶液，混匀，离心数 秒使碎片浸入液体。 C、于56℃保温过夜。 D、用一新的灭菌牙签将碎片中的液体拧干后从管中取出。 E、加500μl苯酚/氯仿/异戊醇，手摇混匀，12000rpm离心3钟。 F、将上清液转移到新的离心管。 G、上清液中加入2.5倍体积预冷的分析纯酒精。 H、手摇混匀试管中的各种成分，放置-20℃10分钟以上。 I、12000rpm离心10分钟。 J、倾去酒精。 K、用1ml室温的70%酒精洗涤。 L、12000rpm离心5分钟。 M、倾去酒精，用移液器吸去残余酒精。 N、真空离心10分钟除去残余酒精，或在100℃以下烘干. O、56℃下用36μl TE溶解DNA，时间至少2小时。 4、从精斑中分离提取DNA 1）试剂 a.TNE缓冲液（1.21g Tris,5.84gNaCl,0.37gEDTA/升） b.20%sarcosyl c.0.39M二硫苏糖醇 d.其它试剂见2.1) 2)步骤 A、从棉签上取下有检材的棉花并置于1.5ml塑料离心管中。 B、管中加入400μl TNE缓冲液；25μl 20%sarcosyl;75μl水；5μl蛋白酶K溶液。手摇混匀，37保温2小时。 C、用一新的灭菌牙签将棉花拧干后从管中取出，再用12000rpm离心5分钟。 D、移上清液（内含裂解细胞或"雌性"片段）于一新的1.5ml管，不要振荡沉淀物（内含非裂解细胞或精子）。再用TNE洗脱沉淀物四次。 E、在有沉淀的管中加入10μlTNE;50μl20%sacrosyl;40μlDTT;150μl水；10μl蛋白酶K溶液。手摇混匀，37℃保温2小时。 F、按3，2）E～O的方法分别抽提出两管中的雌性DNA和精子DNA。 5、用Chelex从全血/血斑中抽提DNA 1）试剂 a.TE b. 5%Chelex 100(w/v于无菌水中) 2）步骤 A、3μl全血或3mm×3mm的血斑置于灭菌的1.5ml离心管中，加入灭菌的1mlTE于管中，振荡数秒。 B、置于室温30分钟，振荡数秒。 C、用12000rpm离心3分钟。 D、弃上清液，保留足够上清液盖没沉淀，勿搅起沉淀。 E、加入200μl 5%Chelex，振荡数秒。 F、于56℃保温30分钟。 G、振荡数秒。 H、沸水浴8分钟。 I、振荡数秒。 J、用12000rpm离心5分钟，上清中为提取的DNA。 6、用Chelex从精斑中抽提DNA 1）试剂 a.TE b.10mg/ml蛋白酶K c.20% Chelex100（w/v于无菌水中） d.洗脱缓冲液(10mM Tris,10mM EDTA,50mMNaCl,2%SDS,Ph7.5) e.1M二硫苏糖醇 2）步骤 A、将附有检材的棉签或纤维置于1.5ml灭菌离心管中，加1ml灭菌的TE，振荡数秒。 B、室温30分钟。 C、振荡数秒。 D、用一新的灭菌牙签将残片拧干后从管中取出。 E、用12000rpm离心3分钟。 F、弃去上清液，但保留约50μl上清液，勿使"细胞沉淀"搅起（若沉淀体积较大，应保留更多上清液，在此例中，保留的上清液体积应为沉淀的2倍）。 G、加150μl灭菌的蒸馏去离子水和2μl蛋白酶K溶液。 H、56℃保温1小时以裂解非精子细胞。 I、用12000rpm离心5分钟，沉淀为"精子沉淀"。 J、取150μl上清液（含裂解细胞组分）及到一新的1.5ml离心管中，再加50μl 20%Chelex，振荡数秒后，稍加离心，然后接步骤O～S进行操作。 K、用0.5ml洗脱缓冲液重新悬浮原管中的沉淀，略加振荡, 用12000rpm 离心5分钟，弃去约450μl上清液。 L、重复步骤K再洗四次。 M、用1ml灭菌的蒸馏去离子水重新悬浮沉淀，稍经振荡，用12000rpm离 心5分钟，弃去950μl上清液。 N、加150μl的5%Chelex，2μl蛋白酶K溶液，7μl 1M的二硫苏糖醇 于"精子组分"，振荡数后，稍加离心。 O、56℃保温1小时。 P、振荡各管数秒。 Q、样品于沸水浴8分钟。 R、振荡数秒。 S、用12000rpm离心3分钟，两管的上清中分别含有非精子细胞DNA和精 子细胞DNA。 四、PCR扩增: 取一支离心管，加（反应管数+1）×（2μl 10×引物混合物+2μl 10×反应混合物+0.4μl HS-Taq（用前必须用手弹匀），混匀后，每个反应管分装4.4μl，然后,加提取的DNA2μl,再加13.6μl ddH2O和一滴石蜡油,（若模板DNA浓度太低,可适当增加其体积,但同时要减少ddH2O体积,以保持总反应体积为20μl）稍离心后按下列条件进行扩增：95℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒；63～56℃退火30秒（每循环一次降低一度）；72℃延伸1分钟，共循环30次。最后72℃保温10分钟。 [ Last edited by fishery on 2005-7-8 at 11:54 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
论文终于录用啦！满足毕业条件了
已经有28人回复
-
假如你的研究生提出不合理要求
已经有4人回复
-
所感
已经有3人回复
-
要不要辞职读博？
已经有7人回复
-
不自信的我
已经有11人回复
-
北核录用
已经有3人回复
-
实验室接单子
已经有3人回复
-
磺酰氟产物，毕不了业了！
已经有8人回复
-
求助:我三月中下旬出站，青基依托单位怎么办？
已经有10人回复
-
26申博（荧光探针方向，有机合成）
已经有4人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
