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核酸提取求助:帮忙分析下失败原因在哪?
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我的提取程序是200ul总消化体积,1%SDS,200ug/ml,消化过夜..... 之后是标准酚氯仿抽提.... 1%琼脂糖凝胶检测 只有最前沿有很弱的拖带出现(疑似RNA) 酚抽提后加入氯仿异戊醇(24:1)后离心后 上清很浑浊 出现大量絮状沉淀(这些是什么 蛋白质么?) , 加入氯仿异戊醇(24:1)后 好象无法混匀 始终是分层状态,这样正常么,不是要摇成乳状,再离心么 我重新提了一次还是这个样子 [ Last edited by linkfuture on 2007-10-12 at 11:58 ] |
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guohuayin
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telomerase(金币+2,VIP+0):thanks!欢迎来多多交流！！！
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抽提核酸中我的做法是 首先加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（体积比25：24：1），轻轻上下颠倒几次，混匀2分钟左右，12000rpm，离心10分钟； 然后吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比24:1)和上面的步骤一样，抽提一次，取上清 这两步试验可以反复三次，主要是去除蛋白质和糖类等杂质。 最后加入1/10体积的3M的醋酸钠（.PH5.3），2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。 －20度放置30分钟，室温15000rpm,离心10分钟，沉淀用70％的乙醇洗涤去除盐分，稍微干燥后，加入适量的缓冲液溶解。－20度冰箱中保存。 [ Last edited by guohuayin on 2007-10-9 at 16:33 ] |
2楼2007-10-09 16:31:15
3楼2007-10-10 12:19:10
yangguoxing888
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4楼2007-10-10 12:31:18
5楼2007-10-10 12:31:23
6楼2007-10-10 13:58:27
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johnsooh(金币+2,VIP+0):欢迎讨论
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谢谢楼上的 回复,,我的提取程序和你的差不多, 是不是我混匀时间太长 太剧烈 导致DNA断裂呢(我每次都要上下颠倒混匀10min) 氯仿异戊醇冷冻离心后为什么上清很浑浊呢 是SDS的遇冷的原因么 还是Pr ======================= 不对。 说太剧烈导致链断裂，最后使得溶液浑浊这个说法太牵强。 我还是同意楼主说的，是消化不彻底的问题。我抽提RNA时，若样本太多，导致Trizol不够用的时候，也会出现大量的浑浊。我想可能是你没有加蛋白酶K，或量太少，导致蛋白消化不彻底，所以后续加酚不能使它沉淀分层。 冷冻后，这些悬在溶液中的蛋白析出，很正常。 所以，从消化开始，再注意点。 欢迎继续探讨！ |
7楼2007-10-10 14:56:23
8楼2007-10-12 12:03:53
9楼2007-10-12 14:29:41
10楼2007-10-12 15:36:47