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（木虫生物专题讨论）之核酸提取纯化专题贴
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———————————————————————————————— 继续招帖子工，招聘链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=910794&fpage=1 ——————————————————————————————————— 不才经过半个多月的整理，核酸提取纯化专题终于完成了。 本专题共分两篇 一为技巧篇 二为解惑篇 其中每篇分别整理成三章： DNA，RNA（含mRNA）和质粒。 请各位多多支持！ 如果你觉得你从中学到了一点东西， 就把它顶起来吧， 让更多的人从中获益~    [ Last edited by raindrop8316 on 2008-8-19 at 08:44 ] |
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 原创 | 关于RNA | 经验 | 音乐的梦 |
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第一章 DNA提取与纯化 主题6：酵母总DNA提取 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=908616&fpage=3 解答1：三磷酸腺苷 qiagen的核酸提取试剂盒一向都很好用 价格也不贵 解答2：aiai3252891 第一种方法，如果你扩增的片段不是很长的话，你可试试将培养的菌放入沸水中煮沸，然后离心。此方法的缺点是容易将总基因组切断，但是很方便。 二、用酶去细胞壁，然后用SDS,EDTA,乙醇抽提，这种方法非常经典，但是操作比较繁琐，但是提取的基因组非常纯净，而且条件温和，不易破坏基因组 主题7：生物活性炭中提取DNA 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=906449&fpage=4 解答1： 三磷酸腺苷 用PBS充分清洗样品，后高速离心（8000~10000rpm左右）把泥土和细胞一起离下去，弃上清，这一步是去掉细胞外的可溶性杂质。 用PBS重悬，然后低速离心把泥土离到管底，但不至于把细胞离下去，这个转速你就好好摸一下就可以了。离过头了就重新震荡混匀，降低转速再试试。然后取上清。 上清里头就含有细胞了，这时候就用经典的酚抽提法提DNA了 主题8：请教影响DNA降解的因素 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=310068&fpage=350 解答1：zhyl1984 酶，和DNA反复冻融 解答2：zw771113 刚提取出来的DNA用TE 溶解时间过长会不会使DNA降解? 不会，TE是金属离子鳌合剂，而核酸酶一般需要有金属离子存在才有活性。所以用TE溶解几个小时DNA都不会降解。 建议你冻存的时候分装保存，用的时候拿一份。就可以避免反复冻溶造成 DNA降解。 主题9：DNA电泳图分析 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=444161&fpage=277 解答1：ldxmhyq 曝光过度了吧。点样孔中有可能是没跑出来的样品，染色染的不好 解答2：xwluo 点样孔太亮,可能是蛋白未去得干净,你用酚、氯仿、异戊醇多抽提几次就可以了 解答3：michaelwuqingyu 蛋白没有去干净，蛋白带正电荷和核酸结合，导致ＤＮＡ在胶孔这跑不出去 解答4：phyllislhy 点样孔里的是蛋白质，RNA提的倒是不错建议你用CTAB法试一下，可能蛋白或糖等杂质比较多，没有提出来。 解答5：vivalk 可能是此生代谢产物较多，建议用经典的CTAB用尽量嫩的部位提取 解答6：天外飞天 RNA没除去,用RNAase消化一下 主题10：电泳图分析（条带不清晰） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=454851&fpage=275 解答1：Doublel 电泳时电压过高会导致电流强度增加，而电流的热效应是和电流的平方成正比的，电流强度过高会直接导致凝胶发热。凝胶发热使DNA分子热运动加剧，扩散速度加快，从而导致条带不清晰。 解答2：levixzhu 1 由于DNA分子量很大，一般建议用0.5-0.8%胶来电泳。PCR产物基本上可以根据分子量来决定胶浓度，一般用1-1.5%的胶浓度。所以建议，你用两块胶分别来跑DNA和PCR产物。 2 电泳电压对band的清晰度和分辨率是由影响的，电压的大小取决于你用的电泳槽正负极间的距离，一般是3-5V/cm。电压过高或过低，对band的清晰度和分辨率都是有影响的。 3 loading buffer的加量，要取决于你用的是几乘的loading buffer，如果是6Xloading buffer，loading buffer的量为你点样量的1/6，那么如果你点样5-6ul，加1ul loading buffer是可以的。如果用的是10Xloading buffer，loading buffer的量为你点样量的1/10，即如果你点样5ul，加0.5ul loading buffer就可以了。但是一般情况下，loading buffer量的多少对于条带的清晰与美观并无太大关系。 4 我们lab用的也是BIO-RAD的凝胶成像系统，说实话，你的条带是不太清晰。 建议A你用制胶的梳子时选择梳子空扁长的，那么条带会好看些。胶浓度也要相应调整。 B因为你的MARKER也不大漂亮，建议电压要优化些，电泳时间要视溴酚兰位于凝胶2/3位置时，可以停止电压。 C 还有你的电泳缓冲液，无论是TBE或是TAE，建议你换新的来电泳。一步步排除问题 |
7楼2008-08-15 17:23:50
I．技巧篇
2楼2008-08-15 17:13:35
3楼2008-08-15 17:15:07
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第三章 质粒提取与纯化 主题1：质粒DNA的分离纯化和鉴定 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=142066&fpage=418 发帖人：okaysee 主题2：一步法提取质粒DNA 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=202040&fpage=398 发帖人：aronxu 主题3：质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=417117&fpage=295 发帖人：raoqun20 主题4：质粒DNA提取试验常见问题解答 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=462010&fpage=270 发帖人：beingking 主题5：质粒DNA的分离、纯化和鉴定 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=543443&fpage=219 发帖人：lgj7966 主题6：转一篇关于质粒DNA提取原理的很棒的文章 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=772205&fpage=71 发帖人：wjswj 以下为付费下载部分 主题7：质粒DNA的提取及浓度检测 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=595213&fpage=189 发帖人：applepie119 主题8：质粒快速提取试剂盒 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=595209&fpage=189 发帖人：applepie119 主题9：质粒DNA的提取和纯化 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=102712&fpage=429 发帖人：pzhangyh 主题10：质粒提取简介及问题分析 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=666139&fpage=141 发帖人：yangym1123 |
4楼2008-08-15 17:17:49