24小时热门版块排行榜

返回列表

当前主题已经存档。

sunlei1981

银虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 238.7
帖子: 74
在线: 13.1小时
虫号: 291838
注册: 2006-10-29
性别: GG
专业: 临床微生物学检验

[交流] 对一些DNA提取方法的总节（欢迎大家补充讨论）

有时候提DNA不是很顺，所以提出来大家讨论一下，因为我是做微生物的，我首先提供一下关于微生物的DNA 提取方法，大家觉的有可以改进的地方，欢迎讨论！！
细菌DNA的提取：
（一）
试剂：
1. 抽提缓冲液
2% CTAB (W/V)
2% PVP K25 (w/v) （去色素）
100mM Tris-HCl (pH8.0)
25mM EDTA (pH8.0)
2.0M NaCl
2.10M LiCl
3. 2M LiCl
4.DEPC-water（抑制RNA酶活性）
5. 3M NaAc (pH5.2)
6. 96% 乙醇
7. 70% 乙醇
步骤：
1.抽提缓冲液65℃预热；
2. 加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min；
3. 加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，离心12,000rpm，10min；
4.取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，离心12,000rpm，10min；
5. 取上清，重复4步骤；
6. 加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C沉淀；
11. 离心12,000rpm，10min；
12. 弃上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。
(二)（我们常用的方法，但是有时有些细菌特别不好提，就用上面的方法）
1. 将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。
2. 取1.5ml培养物12000rpm离心2min。
3. 沉淀物加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.
4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。
5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min, 将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。
6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．
真菌DNA的提取：
（一）
1.取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入4mL提取液，快速振荡混匀
3.加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本的哟！）
4.1000rpm，4℃，5min
5.上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
6.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min
7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 ulTE中
8.加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 hr
9.用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
10.取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
11.沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存备用
DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS，
3M NaAc
（二）
1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次
3．加入1 mL 5M KAc，冰浴20 min
4．等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
5．取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 min
6．用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 L TE中
7．加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 hr
8．用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
9．取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
10．沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ul TE中，-20 ℃保存备用。
以上是我们常用的方法．
据说还有特别简便的一种PCR模板的制作方法，有知道的小虫能说出来分享．

回复此楼