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植物总DNA的提取方法
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植物ＤＮＡ的ＣＴＡＢ提取法： 1 称取新鲜叶片2-3ｇ,剪碎放入研钵中,在液氮中研磨成粉末。2 将粉末转移到的加有7ｍｌ经预热的1 5×ＣＴＡＢ提取缓冲液15ｍｌ离心管中,迅速混匀后置于65℃水浴中,温育30ｍｉｎ。3 取出离心管,冷却至室温,加入氯仿/异戊醇(24:1),充分混匀,室温下2300×ｇ离心20ｍｉｎ。4 将上清转移至另一新的15ｍｌ离心管中,加入1/10体积10%的ＣＴＡＢ和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀,2300×ｇ离心20ｍｉｎ。5 转移上清至另一新的15ｍｌ离心管中,加入等体积1%的ＣＴＡＢ沉淀缓冲液,轻轻摇晃至形成ＤＮＡ絮状沉淀。1000×ｇ离心10ｍｉｎ,使ＤＮＡ沉淀于管底。6 加入1 5-2ｍｌ的1ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ及5μｌＲＮａｓｅ置于56℃水浴中过夜。待ＤＮＡ完全溶解后,加2-3ｍｌ4℃预冷的95%的冰乙醇使ＤＮＡ沉淀,挑出ＤＮＡ,置于1 5ｍｌ离心管中,用70%乙醇清洗30ｍｉｎ,用离心机甩5ｓ,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5ｍｉｎ,倒出95%乙醇,在超净工作台上吹干。7 将风干的ＤＮＡ直接在4℃保存备用或溶于100μｌＴＥ溶液中于-20℃保存。 植物ＤＮＡ的ＳＤＳ提取法： 1 取2-3ｇ新鲜叶片,在液氮中研磨成粉状(防止溶化)后转入15ｍｌ离心管中。2 加入5ｍｌ于65℃预热的提取缓冲液,65℃水浴保温30ｍｉｎ(摇动数次),使提取液与样品充分混合。3 加入2ｍｌ5ｍｏｌ/ＬＫＡｃ,剧烈振荡,冰浴保温20ｍｉｎ以上。4 2700×ｇ离心20ｍｉｎ,将上清液倒入新的15ｍｌ离心管中,(若提取ＤＮＡ用于Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等实验,一般在转移上清时加滤膜,防止样品残渣混入,可保证ＤＮＡ纯度)。5 加入4ｍｌ氯仿/异戊醇(24∶1),摇匀,平衡,2700×ｇ离心15ｍｉｎ。6 在另一新的15ｍｌ离心管中加入5ｍｌ预冷的异丙醇,将上清液用移液枪转入此管,在-20℃冷却30ｍｉｎ以上。7 2700×ｇ离心10ｍｉｎ,弃去上清液,用4ｍｌ70%乙醇洗涤,室温保持10ｍｉｎ。2700×ｇ离心3ｍｉｎ,倒去上清液。8 重复步骤7,用4ｍｌ70%乙醇洗涤,室温保持10ｍｉｎ。2700×ｇ离心3ｍｉｎ,倒去上清液。超净工作台内吹干(3ｈ左右)。9 加1ｍｌＴＥ缓冲液中溶解,加10μｌＲＮａｓｅ(10ｍｇ/ｍｌ),在37℃恒温箱中温育20ｍｉｎ。10 再加100μｌ3ｍｏｌ/ＬＮａＡｃ和2ｍｌ无水乙醇,2700×ｇ离心3ｍｉｎ,倒去上清液。超净工作台内吹干(3ｈ左右)。11 将ＤＮＡ沉淀溶于150μｌＴＥ中,置于超净工作台内(3ｈ左右)。将ＴＥ溶液转入已灭菌的1 5ｍｌｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中,-20℃保存备用。 植物ＤＮＡ的“一管法”提取方法： 1 称取100ｍｇ新鲜植物组织,剪碎置于1 5ｍｌ离心管中,可加入少许无菌石英砂,加入3滴提取缓冲液,用带玻璃钻头的电钻充分研磨匀浆。2 加入400μｌ提取缓冲液,混匀后置于90℃水浴中,不时颠倒摇匀。3 温育20ｍｉｎ后,置于冰浴中5ｍｉｎ,使组织和聚乙烯聚吡咯烷酮(ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ,ＰＶＰＰ)沉淀,置于4℃下保存备用。 适用于ＰＣＲ研究的快速提取法： 1 田间剪取植株新鲜叶片5-10ｍｇ(约2ｃｍ长)左右,新鲜叶片放于1 5ｍｌ离心管中,存于冰盒中,根据样品号贴上相应的标签。2 用剪刀将叶片组织剪细(约0 5ｃｍ长)放在点穴式研板中。3 加入400μｌＤＮＡ提取缓冲液,用玻棒将叶组织研细,直到液体变成深绿色即可。4 再加400μｌＤＮＡ提取缓冲液,混合均匀,转入一新的1 5ｍｌ离心管(贴上相应的编号)。5 加400μｌ氯仿,混合均匀后,2400×ｇ离心30ｓ,将上清液转入一支新的1 5ｍｌ离心管(贴上相应的编号)。6 加800μｌ无水乙醇,混匀,2400×ｇ离心3ｍｉｎ。弃上清。7 70%乙醇冲洗,风干。8 用50μｌＴＥ缓冲液溶解,存于-20℃。9 取1μｌ用于ＰＣＲ分析。 棉花等酚类、多糖类物质较多的植物ＤＮＡ提取法： 1 取2ｇ新鲜幼嫩的叶片放入研钵中,加入液氮后快速、充分研磨,待成极细的粉末状时迅速转入到50ｍｌ离心管中。2 在50ｍｌ离心管中加入10ｍｌ冰预冷的提取缓冲液,在涡悬振荡器上充分混匀。3 于4℃,2700×ｇ离心20分钟,倒去上清液。4 在沉淀中加入5ｍｌ裂解缓冲液,在涡旋振荡器上充分混匀。5 于65℃水浴锅中温育30ｍｉｎ。6 加入5ｍｌ氯仿/异戊醇(24/1),并上下翻转以充分混合。7 于4℃,2700×ｇ离心5分钟。8 转移上层水相至一新的50ｍｌ离心管中。9 重复步骤7-9一次。10 加入2/3体积的冰预冷的异丙醇,并上下翻转以充分混合,至-20℃2ｈ。11 于4℃,1200×ｇ离心10ｍｉｎ。12 在一新管中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液,用玻棒将ＤＮＡ转入该管(如不能直接用玻棒缠出,可离心后倒出上清,再在其中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液),放置20ｍｉｎ后稍许离心,移走上清并吸出残存乙醇,室温干燥。13 加入1 0ｍｌＴＥ(10ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌＰＨ=8 0,1ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ)并加入终浓度为20(ｇ/Ｌ的ＲＮａｓｅＡ,过夜。14 风干,用50μｌＴＥ缓冲液溶解,存于-20℃备用。 |
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