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（木虫生物专题讨论）之核酸提取纯化专题贴
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———————————————————————————————— 继续招帖子工，招聘链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=910794&fpage=1 ——————————————————————————————————— 不才经过半个多月的整理，核酸提取纯化专题终于完成了。 本专题共分两篇 一为技巧篇 二为解惑篇 其中每篇分别整理成三章： DNA，RNA（含mRNA）和质粒。 请各位多多支持！ 如果你觉得你从中学到了一点东西， 就把它顶起来吧， 让更多的人从中获益~    [ Last edited by raindrop8316 on 2008-8-19 at 08:44 ] |
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 原创 | 关于RNA | 经验 | 音乐的梦 |
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第一章 DNA提取与纯化 主题21：关于细菌DNA提取 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=613415&fpage=176 解答1：自然风 芽孢杆菌是阳性菌，溶菌酶终浓度一般需要3mg/ml，可能是你的对照菌株是阴性菌，所以效果较好。酶一般需要保存在—20度（还要避免反复冻融），4度保存很容易失活。 解答2：lingyu20071001 有的阳性菌较难破壁，可以把多加点溶菌酶，对基因组影响应该并不太大， 解答3：goses G+细胞壁都狂厚，代表菌就是金葡了，不过提DNA一般用不上溶菌酶。提质粒是必须用的，我加的5mg/ml，37度应该40-60m，每隔10分钟混悬一次。 溶菌酶最好是粉末存-20，现用现配，溶液存4度不能超过1周 主题22：洗涤DNA有什么技巧么? 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=605008&fpage=176 解答1：wujiequn 个人感觉先把70%的乙醇轻轻倒掉，但不要把EP管倒置于吸水纸上，剩余的一点溶液用小枪吸掉比较好，这时候自然晾干也比较快。 电吹风干燥一般没什么影响，有时候吹得太干了可能会把DNA也吹跑了。 解答2：xuuue 根据外观可以初步判断提取质量，好的DNA 沉淀为白色，干后透明；如果干后仍呈白色，常因蛋白较多；若呈黄至棕色，则是有多酚类杂质；呈胶冻状则含有多糖。 解答3：telomerase 乙醇是直接倒掉（绝大部分）,然后再离心然后用小枪吸净残留乙醇 这样的话很快就干了 ，没吹过电风扇 解答4：wujiequn 不要用吸水纸，太脏了，会污染。直接用小枪头吸出剩余的乙醇。沉淀贴壁牢不牢无所谓，吸的时候注意不要把沉淀吸出来就是了。 解答5：glucidum 一般情况下，用70%乙醇洗的时候DNA是会松动的，能松动是好事。去乙醇的方法像3楼说的那样就很好。至于吹干方面，一般基因组DNA不建议用吹风机吹干，一个是怕吹掉，另外一个原因是干燥过快会引起基因组DNA断裂。如果是 质粒提取的话，那吹干是没问题的。如果超净台比较空闲的话，吸掉乙醇以后放超净台吹干其实也蛮快的。 解答6：angelina-wl 先用70%乙醇洗，12000rpm,2min（可使DNA重新聚在管底）,重复一次，用无水乙醇洗一次（DNA干燥快一些），放在工作台上15~30Min风干即可。 主题23：基因组DNA检测问题 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=623067&fpage=170 解答1：niure 电泳有没看到比较亮的条带啊，有时候分光光度计结果也不要太相信，跑个PCR看下 解答2：xiaopu_yin 分光光度计检测时受洗脱所用的溶液有关，你可以试一下试剂盒提供的洗脱液和双蒸水，误差还是比较大的 解答3：yifanyifan 很多其他成分如糖类,蛋白也影响测定结果, 如果你有对照,比如公司合成的引物,可以测定一下,找找原因.不过大于2.0,理论上应该是RNA污染,你加些RNase 处理样品看看. 解答4：reasonspare 不知道楼主用的什么溶解的DNA，如果是试剂盒的，一半为Tris什么的，这时候浓度比较大一些。 如果你知道你用的试剂盒是什么东东，就更好了， 因为酚也影响，胍也影响。 还有，不要单单看比值，， OD230 和OD260， Od280的实际值 也不要太低 主题24：放线菌基因组DNA的提取方法 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=628829&fpage=162 (1〕取3ml培养过夜的细菌培养物离心0.5分钟，收集菌体； 〔2〕用无菌水洗涤菌体，12000rpm，离心1分钟； 〔3〕沉淀物加入567 u l TE（pH 8.0）缓冲液，重悬菌体，加入30 u l 溶菌酶（50mg/ml）混匀，于37℃温育1小时； 〔4〕加入30 u l 10%的SDS和3 u l （20mg/ml）的蛋白酶K，混匀，于55℃温育1小时； 〔5〕加入100 u l 5M Nacl, 充分混匀，再加入80 u l CTAB/Nacl 溶液，混匀，于65℃温育10min； 〔6〕 加入2ul RNA酶，37℃温浴15分钟； 〔7〕加入等体积的酚/氯仿，混匀，抽提； 〔8〕加入等体积的氯仿，抽提一次； 〔9〕 加入1/10体积的3mol/L NaAc 溶液，2倍体积的无水乙醇，混匀，放置－20℃冰箱30分钟； 〔10〕 轻轻混合直到DNA沉淀下来，离心； 〔11〕 用70%乙醇洗涤沉淀1次，晾干； 〔12〕将已干的DNA溶于40 u l 超纯水中，-20℃保存。 解答1：edragonfly 推荐看一本《链霉菌遗传操作手册》 建议修改： （2）用25mM的EDTA洗 （3）温育时间延长或增加溶菌酶量（貌似你的菌体不少啊） 如果多糖不是很厉害 第5步可以不要 整体步骤应该是没有问题的。 到（9）应该能看到明显的絮状沉淀 没有的话 基本就没提出来了 解答2：liudanlucky 加入溶菌酶温浴直到呈均匀粘稠状。纯度要求不是太高的话可以省去5，6步，4步中加入适量EDTA.第9步中直接用预冷的无水乙醇沉淀也可以。应该没问题，A260/A280可达到1.8-2.0 主题25：猪肝的DNA提取 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=638159&fpage=162 无解答 |
10楼2008-08-15 17:28:35
I．技巧篇
2楼2008-08-15 17:13:35
3楼2008-08-15 17:15:07
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第三章 质粒提取与纯化 主题1：质粒DNA的分离纯化和鉴定 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=142066&fpage=418 发帖人：okaysee 主题2：一步法提取质粒DNA 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=202040&fpage=398 发帖人：aronxu 主题3：质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=417117&fpage=295 发帖人：raoqun20 主题4：质粒DNA提取试验常见问题解答 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=462010&fpage=270 发帖人：beingking 主题5：质粒DNA的分离、纯化和鉴定 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=543443&fpage=219 发帖人：lgj7966 主题6：转一篇关于质粒DNA提取原理的很棒的文章 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=772205&fpage=71 发帖人：wjswj 以下为付费下载部分 主题7：质粒DNA的提取及浓度检测 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=595213&fpage=189 发帖人：applepie119 主题8：质粒快速提取试剂盒 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=595209&fpage=189 发帖人：applepie119 主题9：质粒DNA的提取和纯化 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=102712&fpage=429 发帖人：pzhangyh 主题10：质粒提取简介及问题分析 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=666139&fpage=141 发帖人：yangym1123 |
4楼2008-08-15 17:17:49