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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓

[交流] 求问提取质粒时为什么总是由总DNA?

我近来提取低拷贝质粒(<5)时,电泳检测总是有总DNA条带,酶切验证不是质粒的单独片段,确实存在总DNA。我试过多种方法,如:重新配制溶液,重新纯化菌体,严格实验操作等,但还是有总DNA。比较不幸的是,用同样的材料和方法提取高拷贝的质粒时,居然也出现了总DNA!甚为困惑!
     请高手指点!!
     谢谢!
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asr

荣誉版主 (知名作家)

你用的什么方法呢?

碱法还是CTAB?方法不同,需要注意的是不一样的.
思想极度邪恶,勿怕勿怪!\(^o^)/~
2楼2007-11-05 12:16:17
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jiasanlin

金虫 (小有名气)


johnsooh(金币+1,VIP+0):1悬浮起来,2澄清透明了,3出现絮状沉淀,2,3步骤要注意3楼的意见
如果是碱裂解发提取质粒的时候,一般裂解时间长的化就会混入genome DNA,一般情况下加入溶液2后只要看到菌液清亮,就要马上加入溶液3 终止。变清亮的时间跟收集菌体的量和溶液2的用量有关,分子克隆手册上的不要超过5分钟,只是一个大概的时间。
3楼2007-11-05 17:56:52
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guohuayin

木虫 (著名写手)

博士,副教授

楼上的朋友说的很对,前三步越快越好,并且动作一定要轻柔,不然会造成大量的基因组DNA断裂。
内生菌资源和核酸分子的利用
4楼2007-11-06 08:15:54
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓

引用回帖:
Originally posted by asr at 2007-11-5 12:16:
你用的什么方法呢?

碱法还是CTAB?方法不同,需要注意的是不一样的.

碱变性法提取的!!
5楼2007-11-06 08:19:52
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓

引用回帖:
Originally posted by jiasanlin at 2007-11-5 17:56:
如果是碱裂解发提取质粒的时候,一般裂解时间长的化就会混入genome DNA,一般情况下加入溶液2后只要看到菌液清亮,就要马上加入溶液3 终止。变清亮的时间跟收集菌体的量和溶液2的用量有关,分子克隆手册上的不要超 ...

谢谢!
我已经注意这个问题了,但效果还是不理想!!
6楼2007-11-06 08:20:11
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓

引用回帖:
Originally posted by guohuayin at 2007-11-6 08:15:
楼上的朋友说的很对,前三步越快越好,并且动作一定要轻柔,不然会造成大量的基因组DNA断裂。

谢谢!!
7楼2007-11-06 08:20:25
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lhl1975

银虫 (正式写手)

那你就请别人帮你提一次看看,会不会还是这样
8楼2007-11-06 13:59:03
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angelina-wl


johnsooh(金币+1,VIP+0):thx
加溶液2后动作要轻柔,也要快.不然会打断总DNA,在电泳检测时在靠近口的地方就能看见.
9楼2007-11-06 21:06:13
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随风而过

银虫 (小有名气)


johnsooh(金币+1,VIP+0):thank you very much!
实在没办法,你就跑个电泳切胶回收质粒,质粒的分子量你应该知道吧。提取质粒的时候加容易2的时候要轻柔,最好只是轻轻的颠倒几次就行,千万不要用涡旋混匀器,否则动作大了就会打断总DNA的,
10楼2007-11-07 11:38:25
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