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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求问提取质粒时为什么总是由总DNA？
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓

[交流] 求问提取质粒时为什么总是由总DNA？

我近来提取低拷贝质粒（<5）时，电泳检测总是有总DNA条带，酶切验证不是质粒的单独片段，确实存在总DNA。我试过多种方法，如：重新配制溶液，重新纯化菌体，严格实验操作等，但还是有总DNA。比较不幸的是，用同样的材料和方法提取高拷贝的质粒时，居然也出现了总DNA！甚为困惑！
     请高手指点！！
     谢谢！
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1楼 2007-11-05 09:25:27
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asr

荣誉版主 (知名作家)
你用的什么方法呢?

碱法还是CTAB?方法不同,需要注意的是不一样的.
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思想极度邪恶，勿怕勿怪！\(^o^)/~
2楼2007-11-05 12:16:17
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jiasanlin

金虫 (小有名气)
★
johnsooh(金币+1,VIP+0):1悬浮起来,2澄清透明了,3出现絮状沉淀,2,3步骤要注意3楼的意见
如果是碱裂解发提取质粒的时候，一般裂解时间长的化就会混入genome DNA,一般情况下加入溶液2后只要看到菌液清亮，就要马上加入溶液3 终止。变清亮的时间跟收集菌体的量和溶液2的用量有关，分子克隆手册上的不要超过5分钟，只是一个大概的时间。
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3楼2007-11-05 17:56:52
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guohuayin

木虫 (著名写手)

博士，副教授
楼上的朋友说的很对，前三步越快越好，并且动作一定要轻柔，不然会造成大量的基因组DNA断裂。
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内生菌资源和核酸分子的利用
4楼2007-11-06 08:15:54
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓
引用回帖:
Originally posted by asr at 2007-11-5 12:16:
你用的什么方法呢?

碱法还是CTAB?方法不同,需要注意的是不一样的.

碱变性法提取的！！
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5楼2007-11-06 08:19:52
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓
引用回帖:
Originally posted by jiasanlin at 2007-11-5 17:56:
如果是碱裂解发提取质粒的时候，一般裂解时间长的化就会混入genome DNA,一般情况下加入溶液2后只要看到菌液清亮，就要马上加入溶液3 终止。变清亮的时间跟收集菌体的量和溶液2的用量有关，分子克隆手册上的不要超 ...

谢谢！
我已经注意这个问题了，但效果还是不理想！！
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6楼2007-11-06 08:20:11
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓
引用回帖:
Originally posted by guohuayin at 2007-11-6 08:15:
楼上的朋友说的很对，前三步越快越好，并且动作一定要轻柔，不然会造成大量的基因组DNA断裂。

谢谢！！
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7楼2007-11-06 08:20:25
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lhl1975

银虫 (正式写手)
那你就请别人帮你提一次看看,会不会还是这样
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8楼2007-11-06 13:59:03
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angelina-wl

★
johnsooh(金币+1,VIP+0):thx
加溶液2后动作要轻柔,也要快.不然会打断总DNA,在电泳检测时在靠近口的地方就能看见.
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9楼2007-11-06 21:06:13
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随风而过

银虫 (小有名气)
★
johnsooh(金币+1,VIP+0):thank you very much!
实在没办法，你就跑个电泳切胶回收质粒，质粒的分子量你应该知道吧。提取质粒的时候加容易2的时候要轻柔，最好只是轻轻的颠倒几次就行，千万不要用涡旋混匀器，否则动作大了就会打断总DNA的，
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10楼2007-11-07 11:38:25
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