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clf0803

银虫 (正式写手)

[交流] 求助DNA提取!

这几天一直在提取细菌的DNA,我用的是上海生工的试剂盒,按照试剂盒的说明步骤提取的,可是电泳图上总是不出带,也不知道什么原因?郁闷中!不知大家有没有遇到过这样的问题?你们用的是什么试剂盒,我们实验室其他人用上海生工的试剂盒提DNA的结果都不理想,目的DNA出带都不明显,是不是试剂盒的问题啊?大虾们帮我分析分析阿!谢谢
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guohuayin

木虫 (著名写手)

博士,副教授


johnsooh(金币+1,VIP+0):thx
首先你先检测一下你的有没有提取出DNA,这个问题你可以先测定吸光度,同时也可以测定一下纯度,确定提取出来DNA后,再进行PCR扩增目的基因。扩增的时间一定要加入对照,看看PCR体系有没有问题。
内生菌资源和核酸分子的利用
2楼2007-10-13 08:21:23
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自然风

铁杆木虫 (知名作家)

I'm loving plantsoil


plantsoil(金币+1,VIP+0):thx
你的试剂盒加酶之后处理的时间是不是比较短?因为试剂盒与常规提DNA的方法的差别之一就是试剂盒酶处理的时间要短得多,可能有这方面的原因。

另外,你的试剂盒是否是用柱子回收的?可以试试用常规的酚氯仿代替柱子回收看看,因为对于大片段的DNA,用柱子回收效果稍差。

还有,是不是因为样品的量比较少,才导致检测不清楚?

仅供参考
世事喧嚣,人生寂寞
3楼2007-10-13 14:02:37
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓


plantsoil(金币+1,VIP+0):thx
支持楼上的观点!!
     提取总DNA,破胞很关键!!
     上海生工的试剂盒都是用于一般菌体的提取,对胞外多糖多的细菌和革兰氏阳性菌,一般都比较难提取!
      另外,有时候,试剂盒提取的DNA量非常少,电泳检测不到,但可以用于PCR扩增目的基因,其他操作不宜!!
其实许多传统的方法提取效果都很好的!!
4楼2007-10-13 15:02:49
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clf0803

银虫 (正式写手)

谢谢楼上的高手们!我一般用大概3-5ml的菌液作为一次抽提DNA的样品量,试剂盒加酶后按照说明的处理时间,有时细胞似乎破不了,柱纯化时都离心不下来,后来我延长处理时间,情况似乎改善不大,核酸电泳仍检测不到DNA。不知道高手们都采用什么方法抽提DNA,现在很急啊,大半个月都没提出来,后续实验无法进行,也找不到原因,请大家帮帮忙!
5楼2007-10-13 21:18:38
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xiaopu_yin

金虫 (小有名气)


johnsooh(金币+1,VIP+0):thx
你抽提的是细菌、放线菌还是酵母?我用的是博达泰克的试剂盒,一般用液氮或在-80度反复冻融几次就会有较好的效果。总之破胞很重要,而菌体量过多有时效果反而不好。
6楼2007-10-14 09:23:12
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clf0803

银虫 (正式写手)

我抽提的是革兰氏阴性细菌的DNA
7楼2007-10-14 15:37:30
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