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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 【求助】哪位用TRI zol法提过樱花的总RNA?
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傻子

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助】哪位用TRI zol法提过樱花的总RNA?

用TRI zol法提过几次樱花和樱桃的总RNA都没提出来。哪位提过的，能不能提供一下方法?
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1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能，国家免检优质产品。
1楼2007-05-22 13:25:21
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轻5飞扬

金虫 (正式写手)
把你的方法写下来吧,看看有什么可以改进的地方,一般来讲,TRIzol的方法还是可以的
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2楼2007-05-22 17:13:21
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傻子

木虫 (正式写手)
1. 匀浆处理：将组织在液氮中磨碎，100mg加入1ml TRIzol。
2．将样品在室温（15-30℃）放置5分钟。
3．4℃12000rpm离心10分钟，取上清。
4．加入0.3ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
5．4℃12000rpm离心10分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中。
6．把水相转移到新管中，加入0.5ml异丙醇【多糖样品加入0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)】-20℃放置20分钟。
7．4℃15000rpm离心10分钟，移去上清。
8．用1ml 75℅乙醇洗涤RNA沉淀，使沉淀悬浮。4℃ 8000rpm离心5分钟，弃上清。
9．室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加入40μl DEPC水，用枪头吸打几次，-70℃保存。

我是按这个步骤做的，其他的样品如烟草、番茄可以提的出来，但是樱花、樱桃、桃子都提不出来。
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1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能，国家免检优质产品。
3楼2007-05-22 23:44:08
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
我不是做植物的，问一下樱花、樱桃、桃子是不是富含多糖？
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
4楼2007-05-23 19:01:18
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johnsooh

荣誉版主 (正式写手)

此用户来自小木虫总部信号不好

照着Invitrogen的 trizol说明书，即可提出 Total RNA

如果你是平行作的烟草、番茄可以提的出来，而樱花、樱桃、桃子提不出来，那么可能要求更改针对特殊植物样本的提取方法了，可是，如果不是平行操作，平行电泳检测，则不能说明方法有问题，建议重新作
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___▂▂▃▄▅▆▇█无信号︻╋████�?
5楼2007-05-23 23:19:56
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傻子

木虫 (正式写手)
是平行操作的
今天加了巯基乙醇，RNA是出来了，但是还有很多其他的杂质
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6楼2007-05-24 00:51:22
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傻子

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by telomerase at 2007-5-23 07:01 PM:
我不是做植物的，问一下樱花、樱桃、桃子是不是富含多糖？

糖含量很高，加高盐对RNA的损失很大，不太可行
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1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能，国家免检优质产品。
7楼2007-05-24 00:52:42
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
如果你是提含糖量高的，下面是一个方法，仅供参考，你可以根据他的介绍修改你的试验

从富含多糖的植物组织中提取和纯化RNA

从植物组织中提取高质、高产的RNA比较困难,这主要因为在细胞裂解过程中，自发形成多糖和/或多聚酚，这些物质在组织抽提时与核酸形成复合物，并在后来的乙醇沉淀阶段共同沉淀下来。根据这些污染物的量和性质，所得的乙醇沉淀物可能是凝胶状的，并难于溶解。受多糖和/或多聚苯酚污染的RNA溶液很粘，并且在230 nm有强烈吸收。这种紫外吸收影响A260 对RNA含量的精确定量。而且污染的RNA不适于进行cDNA分析，反转录PCR扩增，体外翻译，或Northern 分析。生长在不同环境条件下的不同物种和相同物种，成功分离RNA的条件有显著的差异。将植物暴露于高浓度CO2常导致整个叶子糖类大量的增加，尤其是淀粉和多糖。因此在高浓度CO2环境中生长植物的RNA分离，碳水化合物的污染问题更突出。植物组织一般用SDS/苯酚或硫氰酸胍提取RNA。为了克服多聚苯酚和/或多糖污染的问题，一些人用诸如氯化铯梯度沉淀或不同溶剂沉淀。然而在去除污染时，这些方法并非总是有效。因此需要建立简单、可信、廉价的方法提取干净高效的RNA。下面介绍硫氰酸胍提取方法，硫氰酸胍能溶解细胞并使蛋白变性，当用于抽提缓冲液时，可产生无RNase的环境。组织抽提后，以中等转速离心匀浆液，以除去不溶性多糖。用苯酚/氯仿将上清液抽提出，RNA位水相，DNA和蛋白质位于苯酚相和两相交界面。用醋酸钾将位于水相的多糖选择性的沉淀出来。然后用氯化锂选择性将RNA从残余的污染物中纯化出来。该方法成功从多种在高浓度CO2环境中生长的植物中提取了叶子RNA，证明了该方法的有效性。

（一）材料与设备

1.        0.75mol/L 柠檬酸钠，pH 7.0 (含柠檬酸)。用0.1% DEPC处理并高压灭菌。
2.        10% (w/v) N-月桂肌氨酸（N-lauroyl sarcosine）。
3.        硫氰酸胍缓冲液：用293 ml无菌去离子水，17.6ml 0.75 mol/L 柠檬酸钠，26.4ml 10% N-十二醇肌氨酸钠，在厂家药瓶内于65℃溶解250g 硫氰酸胍（不用称重）。
4.        抽提缓冲液：每5ml 硫氰酸胍缓冲液加36µl 巯基乙醇。若被提取组织含多聚苯酚，抽提缓冲液中可加入聚乙烯聚吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrolidone）(20% w/w)。
5.        氯仿/异戊醇49：1（v/v）。
6.        2 mol/L 醋酸钠，加乙酸至pH 4.0 。
7.        酸性苯酚：500g 晶体苯酚溶于500ml去离子水中，50ml每份于－20℃保存，4℃可保存一个月。
8.        异丙醇。
9.        70%和100%乙醇。
10.        2 mol/L 醋酸钾，加冰醋酸至pH 4.8。
11.        1O mol/L LiC1。
12.        TNE 缓冲液：10mmol/L Tris-HC1, pH 7.5, 室温, 150mmol/L NaC1, 1 mmol/L EDTA。
13.        TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HC1, pH 7.5, 1mmol/L EDTA。
14.        研钵和研杵。
15.        液氮。
16.        离心机。
17.        玻璃Pasteur 吸量管，200℃干烤至少3小时。

（二）操作方法

1.        在液氮中将0.4g 组织研磨为细粉末，勿让组织解冻。
2.        在研磨过程中，加入3.5ml抽提缓冲液，充分研磨。将匀浆转移到一个10ml聚丙烯管。用1ml抽提缓冲液冲洗研杵和研钵，然后移至聚丙烯管中。
3.        23000g，4℃，离心20 分钟。
4.        用烤过的玻璃吸量管将上层悬浮液移入10ml 聚丙烯管。
5.        加0.4ml 2mol/L 醋酸钠，混合混匀。加4ml苯酚，混匀。加0.8ml氯仿/异戊醇，混匀。
6.        聚丙烯管置于冰上 15 分钟。
7.        离心，方法如步骤3。
8.        用烤过的玻璃吸量管将上层悬浮液移入30ml 聚丙烯管，加入同样容积的         2mol/L 醋酸钾，混合混匀。
9.        聚丙烯管置于冰上至少30 分钟。
10.        44000g，4℃离心20 分钟。
11.        将上清液移入15ml 聚丙烯管，加0.6-1 倍体积的100%的冰异丙醇，混匀，-20℃ 放置45 分钟。
12.        以2700g，于4℃离心20 分钟。
13.        轻轻倒出上清液，用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀，如步骤12离心3 分钟，尽可能将乙醇倒净。
14.        加入400µl DEPC 处理的水溶解沉淀，移至1.5ml管中。
15.        加100µl 10mol/L LiC1, 4℃ 放置至少2 h。
16.        12000g，4℃离心20 分钟 。
17.        用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀两次。
18.        加入200µl TNE 重悬沉淀，再加500µl 100% 乙醇，-20℃ 放置至少15 分钟。
19.        如步骤16离心5分钟 。
20.        用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀两次。
21.        加入200-400µl TE 重悬沉淀。
22.        将每个样本稀释30-50倍，在 230nm，260nm，280nm测量吸光度。

（三）注意事项

1.        开始的离心去除了大部分不溶性多聚糖，如淀粉颗粒。残余的组织在管的底部形成暗绿色沉淀（若用的是叶子），不溶性多糖在残余组织上面形成灰白色胶状层。
2.        当吸取上清液时，应十分小心，勿搅乱胶状沉淀，因为该层非常软。上清液的体积大约4 ml，若因沉淀多而使体积明显不足时，用抽提缓冲液补足。
3.        加入乙酸钾后，延长孵育时间（达30 分钟）会提高 RNA 的质量，尤其出现蛋白污染时。多糖形成灰白色胶状沉淀。若所用的组织多糖含量高，延长孵育时间（至60 分钟）也有助于沉淀更多的多糖。
4.        加入异丙醇后，不应看到沉淀，任何可见的沉淀表明大量多糖的存在。孵育时间大于60 分钟，就会形成多糖沉淀。
5.        RNA 沉淀应为白色，若有灰白色胶状沉淀则为多糖污染。遇到该情况，将沉淀再悬浮于200µl TE，加1倍体积的2mol/L 醋酸钾，冰上孵育30 分钟。12,000g ，4℃离心 20 分钟。将上清液移至一新1.5ml 管中，用2.5 倍体积的100% 乙醇沉淀RNA，-20℃，15 分钟. 继续方法中的步骤16。
6.        判断RNA分离的成功与否，测量在230，260，280nm处的紫外吸收可以评估RNA的产量和质量。若A260／230值小于2，则表明多糖和/或多聚苯酚污染；若A260:A280比值小于1.7，表明蛋白污染。在琼脂糖凝胶上出现的28S和18S rRNA，可用以评估RNA的完整性。
7.        该方法提取的RNA适于poly(A)＋的分离，Northern 分析，cDNA 分析，RT-PCR扩增。
参考文献
1.        Lopez-Gomez, R. and Gomez-Lim, M. A. A method for extracting intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe Mango mesocarp. HortScience,1992,27: 440-442.
2.        Mitra, D. and Kootstra, A. Isolation of RNA from apple skin. Plant Mol.Biol. Reptr. 1993,11:326-332.
3.        Newbury, H. J. and Possingham, J. V.. Factors affecting the extraction of intact ribonucleic acid from plant tissues containing interfering phenolic compounds. Plant Physiol. 1977,60: 543-547.
4.        Schultz, D. J., Craig, R., Cox-Foster,et al. RNA isolation from recalcitrant plant tissue. Plant Mol. Biol. Reptr. 1994, 12: 310-316.
5.        Wang, C.-S. and Vodkin L. O. Extraction of RNA from tissues containing high levels of procyanidins that bind RNA. Plant Mol. Biol. Reptr. 1994, 12: 132-145.
6.        Lay-Yee, M., DellaPenna, D., and Ross, G. S. Changes in mRNA and protein during ripening of apple fruit (Malus domestica Borkh. cv. Golden Delicious). Plant Physiol. 1990,94: 850-853.
7.        Tesniere, C. and Vayda, M. E. Method for the isolation of high-quality RNA from grape berry tissues without contaminating tannins or carbohydrates.  Plant Mol. Biol. Repth, 1991,9: 242-251.
8.        Chomczynski, P. and Sacchi, N. Single-step methods of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 1987,162: 156-159.
9.        Glisin, V., Crkvenjakov, R., and Byus, C. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry, 1974,13: 2633-2637.
10.        Manning, K. Isolation of nucleic acids from plants by differential solvent precipitation. Anal. Biochem. 1991,195: 45-50.
11.        Ainsworth, C. Isolation of RNA from floral tissue of Rumex acetosa (sorrel). Plant Mol. Biol. Reptr. 1994, 12: 198-203.

[ Last edited by telomerase on 2007-5-24 at 10:32 ]
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8楼2007-05-24 10:30:49
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收到！谢谢，楼上的。
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9楼2007-05-24 21:31:14
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