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傻子木虫 (正式写手)
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【求助】哪位用TRI zol法提过樱花的总RNA?
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| 用TRI zol法提过几次樱花和樱桃的总RNA都没提出来。哪位提过的，能不能提供一下方法? |
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4楼2007-05-23 19:01:18
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如果你是提含糖量高的，下面是一个方法，仅供参考，你可以根据他的介绍修改你的试验 从富含多糖的植物组织中提取和纯化RNA 从植物组织中提取高质、高产的RNA比较困难,这主要因为在细胞裂解过程中，自发形成多糖和/或多聚酚，这些物质在组织抽提时与核酸形成复合物，并在后来的乙醇沉淀阶段共同沉淀下来。根据这些污染物的量和性质，所得的乙醇沉淀物可能是凝胶状的，并难于溶解。受多糖和/或多聚苯酚污染的RNA溶液很粘，并且在230 nm有强烈吸收。这种紫外吸收影响A260 对RNA含量的精确定量。而且污染的RNA不适于进行cDNA分析，反转录PCR扩增，体外翻译，或Northern 分析。生长在不同环境条件下的不同物种和相同物种，成功分离RNA的条件有显著的差异。将植物暴露于高浓度CO2常导致整个叶子糖类大量的增加，尤其是淀粉和多糖。因此在高浓度CO2环境中生长植物的RNA分离，碳水化合物的污染问题更突出。植物组织一般用SDS/苯酚或硫氰酸胍提取RNA。为了克服多聚苯酚和/或多糖污染的问题，一些人用诸如氯化铯梯度沉淀或不同溶剂沉淀。然而在去除污染时，这些方法并非总是有效。因此需要建立简单、可信、廉价的方法提取干净高效的RNA。下面介绍硫氰酸胍提取方法，硫氰酸胍能溶解细胞并使蛋白变性，当用于抽提缓冲液时，可产生无RNase的环境。组织抽提后，以中等转速离心匀浆液，以除去不溶性多糖。用苯酚/氯仿将上清液抽提出，RNA位水相，DNA和蛋白质位于苯酚相和两相交界面。用醋酸钾将位于水相的多糖选择性的沉淀出来。然后用氯化锂选择性将RNA从残余的污染物中纯化出来。该方法成功从多种在高浓度CO2环境中生长的植物中提取了叶子RNA，证明了该方法的有效性。 （一）材料与设备 1. 0.75mol/L 柠檬酸钠，pH 7.0 (含柠檬酸)。用0.1% DEPC处理并高压灭菌。 2. 10% (w/v) N-月桂肌氨酸（N-lauroyl sarcosine）。 3. 硫氰酸胍缓冲液：用293 ml无菌去离子水，17.6ml 0.75 mol/L 柠檬酸钠，26.4ml 10% N-十二醇肌氨酸钠，在厂家药瓶内于65℃溶解250g 硫氰酸胍（不用称重）。 4. 抽提缓冲液：每5ml 硫氰酸胍缓冲液加36µl 巯基乙醇。若被提取组织含多聚苯酚，抽提缓冲液中可加入聚乙烯聚吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrolidone）(20% w/w)。 5. 氯仿/异戊醇49：1（v/v）。 6. 2 mol/L 醋酸钠，加乙酸至pH 4.0 。 7. 酸性苯酚：500g 晶体苯酚溶于500ml去离子水中，50ml每份于－20℃保存，4℃可保存一个月。 8. 异丙醇。 9. 70%和100%乙醇。 10. 2 mol/L 醋酸钾，加冰醋酸至pH 4.8。 11. 1O mol/L LiC1。 12. TNE 缓冲液：10mmol/L Tris-HC1, pH 7.5, 室温, 150mmol/L NaC1, 1 mmol/L EDTA。 13. TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HC1, pH 7.5, 1mmol/L EDTA。 14. 研钵和研杵。 15. 液氮。 16. 离心机。 17. 玻璃Pasteur 吸量管，200℃干烤至少3小时。 （二）操作方法 1. 在液氮中将0.4g 组织研磨为细粉末，勿让组织解冻。 2. 在研磨过程中，加入3.5ml抽提缓冲液，充分研磨。将匀浆转移到一个10ml聚丙烯管。用1ml抽提缓冲液冲洗研杵和研钵，然后移至聚丙烯管中。 3. 23000g，4℃，离心20 分钟。 4. 用烤过的玻璃吸量管将上层悬浮液移入10ml 聚丙烯管。 5. 加0.4ml 2mol/L 醋酸钠，混合混匀。加4ml苯酚，混匀。加0.8ml氯仿/异戊醇，混匀。 6. 聚丙烯管置于冰上 15 分钟。 7. 离心，方法如步骤3。 8. 用烤过的玻璃吸量管将上层悬浮液移入30ml 聚丙烯管，加入同样容积的 2mol/L 醋酸钾，混合混匀。 9. 聚丙烯管置于冰上至少30 分钟。 10. 44000g，4℃离心20 分钟。 11. 将上清液移入15ml 聚丙烯管，加0.6-1 倍体积的100%的冰异丙醇，混匀，-20℃ 放置45 分钟。 12. 以2700g，于4℃离心20 分钟。 13. 轻轻倒出上清液，用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀，如步骤12离心3 分钟，尽可能将乙醇倒净。 14. 加入400µl DEPC 处理的水溶解沉淀，移至1.5ml管中。 15. 加100µl 10mol/L LiC1, 4℃ 放置至少2 h。 16. 12000g，4℃离心20 分钟 。 17. 用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀两次。 18. 加入200µl TNE 重悬沉淀，再加500µl 100% 乙醇，-20℃ 放置至少15 分钟。 19. 如步骤16离心5分钟 。 20. 用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀两次。 21. 加入200-400µl TE 重悬沉淀。 22. 将每个样本稀释30-50倍，在 230nm，260nm，280nm测量吸光度。 （三）注意事项 1. 开始的离心去除了大部分不溶性多聚糖，如淀粉颗粒。残余的组织在管的底部形成暗绿色沉淀（若用的是叶子），不溶性多糖在残余组织上面形成灰白色胶状层。 2. 当吸取上清液时，应十分小心，勿搅乱胶状沉淀，因为该层非常软。上清液的体积大约4 ml，若因沉淀多而使体积明显不足时，用抽提缓冲液补足。 3. 加入乙酸钾后，延长孵育时间（达30 分钟）会提高 RNA 的质量，尤其出现蛋白污染时。多糖形成灰白色胶状沉淀。若所用的组织多糖含量高，延长孵育时间（至60 分钟）也有助于沉淀更多的多糖。 4. 加入异丙醇后，不应看到沉淀，任何可见的沉淀表明大量多糖的存在。孵育时间大于60 分钟，就会形成多糖沉淀。 5. RNA 沉淀应为白色，若有灰白色胶状沉淀则为多糖污染。遇到该情况，将沉淀再悬浮于200µl TE，加1倍体积的2mol/L 醋酸钾，冰上孵育30 分钟。12,000g ，4℃离心 20 分钟。将上清液移至一新1.5ml 管中，用2.5 倍体积的100% 乙醇沉淀RNA，-20℃，15 分钟. 继续方法中的步骤16。 6. 判断RNA分离的成功与否，测量在230，260，280nm处的紫外吸收可以评估RNA的产量和质量。若A260／230值小于2，则表明多糖和/或多聚苯酚污染；若A260:A280比值小于1.7，表明蛋白污染。在琼脂糖凝胶上出现的28S和18S rRNA，可用以评估RNA的完整性。 7. 该方法提取的RNA适于poly(A)＋的分离，Northern 分析，cDNA 分析，RT-PCR扩增。 参考文献 1. Lopez-Gomez, R. and Gomez-Lim, M. A. A method for extracting intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe Mango mesocarp. HortScience,1992,27: 440-442. 2. Mitra, D. and Kootstra, A. Isolation of RNA from apple skin. Plant Mol.Biol. Reptr. 1993,11:326-332. 3. Newbury, H. J. and Possingham, J. V.. Factors affecting the extraction of intact ribonucleic acid from plant tissues containing interfering phenolic compounds. Plant Physiol. 1977,60: 543-547. 4. Schultz, D. J., Craig, R., Cox-Foster,et al. RNA isolation from recalcitrant plant tissue. Plant Mol. Biol. Reptr. 1994, 12: 310-316. 5. Wang, C.-S. and Vodkin L. O. Extraction of RNA from tissues containing high levels of procyanidins that bind RNA. Plant Mol. Biol. Reptr. 1994, 12: 132-145. 6. Lay-Yee, M., DellaPenna, D., and Ross, G. S. Changes in mRNA and protein during ripening of apple fruit (Malus domestica Borkh. cv. Golden Delicious). Plant Physiol. 1990,94: 850-853. 7. Tesniere, C. and Vayda, M. E. Method for the isolation of high-quality RNA from grape berry tissues without contaminating tannins or carbohydrates. Plant Mol. Biol. Repth, 1991,9: 242-251. 8. Chomczynski, P. and Sacchi, N. Single-step methods of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 1987,162: 156-159. 9. Glisin, V., Crkvenjakov, R., and Byus, C. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry, 1974,13: 2633-2637. 10. Manning, K. Isolation of nucleic acids from plants by differential solvent precipitation. Anal. Biochem. 1991,195: 45-50. 11. Ainsworth, C. Isolation of RNA from floral tissue of Rumex acetosa (sorrel). Plant Mol. Biol. Reptr. 1994, 12: 198-203. [ Last edited by telomerase on 2007-5-24 at 10:32 ] |
8楼2007-05-24 10:30:49