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（木虫生物专题讨论）之核酸提取纯化专题贴
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———————————————————————————————— 继续招帖子工，招聘链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=910794&fpage=1 ——————————————————————————————————— 不才经过半个多月的整理，核酸提取纯化专题终于完成了。 本专题共分两篇 一为技巧篇 二为解惑篇 其中每篇分别整理成三章： DNA，RNA（含mRNA）和质粒。 请各位多多支持！ 如果你觉得你从中学到了一点东西， 就把它顶起来吧， 让更多的人从中获益~    [ Last edited by raindrop8316 on 2008-8-19 at 08:44 ] |
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 原创 | 关于RNA | 经验 | 音乐的梦 |
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第一章 DNA提取与纯化 主题26：提植物DNA时出现的问题（上清液墨绿色） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=639732&fpage=156 解答1：wenyangapple 我们实验室的protocol是这样的，你参考一下，看看能不能有所启发。 200微升CTAB研磨；加300微升CTAB; 65度水浴20分钟；加氯仿-异戊醇（24:1）震荡，离心，取上清；加等体积异丙醇，离心弃上清；洗涤，溶解。 我估计是你用的提取液不好了。 解答2：wdf1980122 转速不够 解答3：wdgsmv58 离心时间和转速不够 解答4：henghengyouyou 深绿色的溶液是对的，你还要其他几步在去除蛋白等 解答5：如来神掌 提取液加少了 解答6： glenn_007 加入提取液后，再用氯仿-异戊醇抽提2～3次去除蛋白干扰。每次缓慢颠转50次左右，然后离心，就可以得到上清液了。 主题27：细菌基因组DNA为什么提不出来？ 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=627321&fpage=155 解答1：reasonspare 如果出现多糖等物质需要洗涤几次，推荐TES， 其他可以用生理盐水或者灭菌去离子水， 1 ok 应该 2 加入TE后加入 lysome 37 度 1 h 或 更长时间，或者反复冻融（-20- 20度）超声波也可以考虑）总之先打破细胞壁。 加如 pro K 1h 去蛋白 3 加入 ＳＤＳ 后重复振荡，37 度 30min 或更长， 其他 不变， 解答2：hudong 请你检查一下你用的所有试剂，试剂出问题的话也是没有 DNA。如果是一点DNA都没有的话，那很可能是试剂出问题了。建议重换试剂试试，或同时用其它方法试试。还有，你是小提，不用摇那么多的菌，用试管摇5ml就够了。 解答3：fengkai6200 我是从肌肉组织提的dna。我加的SDS的量比你大，100ul10%SDS。在55度反应2小时。当然因为肌肉组织不好裂解，所以比提菌的DNA多加了SDS，提高了反应温度。 我觉得你可以适当的改变一下条件，加大点SDS的量，或延长反应的时间。 我这方法提取的DNA质量很好的，没有降解，做pcr的效果也很好的 解答4：li3564617 dna沉淀使用肉眼看不见的，你不妨提完后跑个电泳看看，上述方法应该没问题，我用上海生工的试剂盒用的方法根你的差不多，效果也不错。 我们用无水乙醇沉淀，加入等体积的无水乙醇，-20摄氏度放置10分钟，然后4度离心 解答5： edragonfly ctab和DNA在低浓度Na离子时会发生结合 具体浓度是多少不记得了 自己查一下 解答6：genehsy 第六步中可以加1/10体积的3mol/L的醋酸钠促进DNA沉淀。 另外还有一种简单的方法你可以试一试，收集菌体用TE悬浮后直接用等体积的苯酚：氯仿（1：1）混合液直接抽提，离心取上清液，醇沉即可。 解答7：wbz66 DNA提取之后是看不见的,能看见的是一些蛋白质的杂质,建议跑个电泳看一下最好 解答8：bbzhangzhang 一个超级高手经常提醒我，抽提，一定首先把菌或细胞器充分裂解！ 我个人强烈建议你在适当的裂解步骤加上剧烈涡旋2min，其他步骤暂时不变，相信会有作用。另外我查了，“CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可以从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA ”。你看盐离子浓度是否合乎CTAB结合与分离核酸的要求，再做调整 主题28：花生DNA提取出现的问题 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=645796&fpage=153 解答1：deepbluewater 你换SDS法试试？或者用液氮法？其实CTAB法除多糖的效果较好，但是对样品要做些前处理，我作的样品在CTAB之前需要用乙醇溶液浸泡，你可以试试对样品进行前处理（例如乙醇溶液浸泡，PVP浸泡【但是PVP浸泡容易导致DNA浓度过低，琼脂糖凝胶检测时条带不明显】） 解答2：glenn_007 离心后，取上清电泳试试？我觉得你应该是提取到了 SDS法适合蛋白含量较高的样品，CTAB适合多糖成分含量较高的样品。视具体情况而定 主题29：细菌基因组DNA抽提的问题（多条带） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=662031&fpage=139 无解答 主题30：氧颗粒污泥总DNA提取（附电泳图） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=675053&fpage=138 解答1：xiaoyu1014126 你把土样都放冰箱里，有些能产芽孢的菌都产生芽孢，这对实验啊有影响啊？ 解答2：lxlxyc CTAB/NaCL在温度低的情况下结晶，放在65摄氏度水浴，直到结晶彻底溶解。水浴时不停摇动。 |
11楼2008-08-15 17:29:48
I．技巧篇
2楼2008-08-15 17:13:35
3楼2008-08-15 17:15:07
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第三章 质粒提取与纯化 主题1：质粒DNA的分离纯化和鉴定 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=142066&fpage=418 发帖人：okaysee 主题2：一步法提取质粒DNA 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=202040&fpage=398 发帖人：aronxu 主题3：质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=417117&fpage=295 发帖人：raoqun20 主题4：质粒DNA提取试验常见问题解答 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=462010&fpage=270 发帖人：beingking 主题5：质粒DNA的分离、纯化和鉴定 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=543443&fpage=219 发帖人：lgj7966 主题6：转一篇关于质粒DNA提取原理的很棒的文章 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=772205&fpage=71 发帖人：wjswj 以下为付费下载部分 主题7：质粒DNA的提取及浓度检测 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=595213&fpage=189 发帖人：applepie119 主题8：质粒快速提取试剂盒 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=595209&fpage=189 发帖人：applepie119 主题9：质粒DNA的提取和纯化 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=102712&fpage=429 发帖人：pzhangyh 主题10：质粒提取简介及问题分析 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=666139&fpage=141 发帖人：yangym1123 |
4楼2008-08-15 17:17:49
