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（木虫生物专题讨论）之核酸提取纯化专题贴
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———————————————————————————————— 继续招帖子工，招聘链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=910794&fpage=1 ——————————————————————————————————— 不才经过半个多月的整理，核酸提取纯化专题终于完成了。 本专题共分两篇 一为技巧篇 二为解惑篇 其中每篇分别整理成三章： DNA，RNA（含mRNA）和质粒。 请各位多多支持！ 如果你觉得你从中学到了一点东西， 就把它顶起来吧， 让更多的人从中获益~    [ Last edited by raindrop8316 on 2008-8-19 at 08:44 ] |
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 原创 | 关于RNA | 经验 | 音乐的梦 |
| 实验相关 |
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第一章 DNA提取与纯化 主题16：植物线粒体DNA的提取 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=569136&fpage=206 无解答 主题17：CTAB法提DNA出现问题（碎末状沉淀） 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=578068&fpage=195 解答1：guohuayin 我觉得碎末状沉淀是你没有去除干净的蛋白质，在苯酚－氯仿重提阶段，建议不要为了获取大量的的DNA而将中间的那层吸出来，那层是蛋白质，吸取上清液的时候，在最后快要吸完的时候，最好不要继续吸出了，防止蛋白质污染。建议你用苯酚－氯仿抽提一次，再用氯仿：异戊醇抽提一次。并且用70％的酒精多洗涤几次，酒精洗涤的作用主要是去除盐分。最后酒精洗涤完后，一定要晾干后再用适量的双蒸水溶解或者TE缓冲液溶解。 解答2：沙砾 建议大家在做DNA沉淀的时候加入1/10体积的3M的醋酸钠，再加无水乙醇，沉淀效果会更好 主题18：提取DNA检测发现三条带，谁能解释? 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=584447&fpage=195 解答1：tuotuozw 材料，过程都有可能造成DNA的怪异现象出现 解答2：xuuue 可能是连同RNA一起提了出来，这很正常，你去RNA了吗？ 解答3：如果泳道没有明显弥散现象，而且LZ电泳中出现的3条带中的2条挨得很进，且与第3条距离较远的话，那多数应该是xuuue所说的提取样品中混有RNA，加点RNaseA处理一下就可以了。 主题19：核酸提取求助:帮忙分析下失败原因在哪? 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=593897&fpage=188 解答1：guohuayin 抽提核酸中我的做法是 首先加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（体积比25：24：1），轻轻上下颠倒几次，混匀2分钟左右，12000rpm，离心10分钟； 然后吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比24:1)和上面的步骤一样，抽提一次，取上清 这两步试验可以反复三次，主要是去除蛋白质和糖类等杂质。 最后加入1/10体积的3M的醋酸钠（.PH5.3），2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。 －20度放置30分钟，室温15000rpm,离心10分钟，沉淀用70％的乙醇洗涤去除盐分，稍微干燥后，加入适量的缓冲液溶解。－20度冰箱中保存。 解答2：yangguoxing888 应该和上下颠倒的时间没关系。没准是你基因组提取后溶解，如果缓冲液多得话DNA浓度会低，这样也不一定能跑出来，至于前端的东西，没准是RNA。 解答3：tsguest 你上下颠倒混匀的时间太长了，这样容易把DNA弄断，而且如果你要是需要大片段的DNA，这样做更是不行。你如果把DNA一提出来，马上就跑，有可能就什么也跑不出来，你可以用TE溶了DNA后，在4度放置一晚，第二天再跑电泳就有可能有你提的DNA， 解答4：yzh-1999 说太剧烈导致链断裂，最后使得溶液浑浊这个说法太牵强。 我还是同意楼主说的，是消化不彻底的问题。我抽提RNA时，若样本太多，导致Trizol不够用的时候，也会出现大量的浑浊。我想可能是你没有加蛋白酶K，或量太少，导致蛋白消化不彻底，所以后续加酚不能使它沉淀分层。 冷冻后，这些悬在溶液中的蛋白析出，很正常。 所以，从消化开始，再注意点。 解答5：insect2004 你用的EB染色是不是浓度太低，或用的时间太长，把EB换成新的，另外加上MARK, 这样如果MARK跑出来而你的DNA没有跑出来，那就说明不是染色的问题，你再找别的原因，如果你不是用试剂盒提得，那你就检查一下你的关键试剂有没有问题，原因得一步步找，实验做得多了，你的经验也就多了，你再多提几次 解答6：yzh-1999 前面那些弥散条带可能是RNA，降解的DNA等等。 建议重新配制和准备试剂， 消化时间长一些，比如甚至可以将正在消化的样品在37度的摇床上过夜 解答6：insect2004 把样品保存在－80度，保存1－2年不会有问题，如果你们实验室没有超低温冰箱，那你就把样品保存在－20度，保存一两个月应该没有问题。关键试剂重新配，也不费多少事 主题20：求助DNA提取！ 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=597267&fpage=187 解答1：guohuayin 首先你先检测一下你的有没有提取出DNA，这个问题你可以先测定吸光度，同时也可以测定一下纯度，确定提取出来DNA后，再进行PCR扩增目的基因。扩增的时间一定要加入对照，看看PCR体系有没有问题。 解答2：自然风 你的试剂盒加酶之后处理的时间是不是比较短？因为试剂盒与常规提DNA的方法的差别之一就是试剂盒酶处理的时间要短得多，可能有这方面的原因。 另外，你的试剂盒是否是用柱子回收的？可以试试用常规的酚氯仿代替柱子回收看看，因为对于大片段的DNA，用柱子回收效果稍差。 还有，是不是因为样品的量比较少，才导致检测不清楚？ 解答3：bioartist 提取总DNA，破胞很关键！！ 上海生工的试剂盒都是用于一般菌体的提取，对胞外多糖多的细菌和革兰氏阳性菌，一般都比较难提取！ 另外，有时候，试剂盒提取的DNA量非常少，电泳检测不到，但可以用于PCR扩增目的基因，其他操作不宜！ 其实许多传统的方法提取效果都很好的！！ 解答4：xiaopu_yin 你抽提的是细菌、放线菌还是酵母？我用的是博达泰克的试剂盒，一般用液氮或在－80度反复冻融几次就会有较好的效果。总之破胞很重要，而菌体量过多有时效果反而不好。 |
9楼2008-08-15 17:27:11
I．技巧篇
2楼2008-08-15 17:13:35
3楼2008-08-15 17:15:07
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第三章 质粒提取与纯化 主题1：质粒DNA的分离纯化和鉴定 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=142066&fpage=418 发帖人：okaysee 主题2：一步法提取质粒DNA 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=202040&fpage=398 发帖人：aronxu 主题3：质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=417117&fpage=295 发帖人：raoqun20 主题4：质粒DNA提取试验常见问题解答 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=462010&fpage=270 发帖人：beingking 主题5：质粒DNA的分离、纯化和鉴定 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=543443&fpage=219 发帖人：lgj7966 主题6：转一篇关于质粒DNA提取原理的很棒的文章 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=772205&fpage=71 发帖人：wjswj 以下为付费下载部分 主题7：质粒DNA的提取及浓度检测 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=595213&fpage=189 发帖人：applepie119 主题8：质粒快速提取试剂盒 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=595209&fpage=189 发帖人：applepie119 主题9：质粒DNA的提取和纯化 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=102712&fpage=429 发帖人：pzhangyh 主题10：质粒提取简介及问题分析 链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=666139&fpage=141 发帖人：yangym1123 |
4楼2008-08-15 17:17:49