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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大
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董庄青年

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大已有7人参与

最近做PCR很郁闷  如图： 目的条带（上面  浅浅的）太弱     引物二聚体（下面)很亮  
PCR条件优化时要么带很浅  要么没有带   最后优化成下图所示  带一直很浅  求解   先谢谢各位！！！
引物是生工刚合成的    模板是新提的   带都很亮   
PCR体系(25ul)：10×buffer: 2.5ul     dNTP-MIX(10mM): 0.5ul     引物（10um)：各1.5ul        模板（4kb): 1ul（150ng左右）   Tap DNA Polymerase(5U/ul):  0.5 ul   水:17.5ul
PCR程序：94℃  5min; 94℃  1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃  10min；共20个循环::cat39

PCR目的条带太弱 并无非特异性条带  怎样改进可以使目的产物的量加大
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1楼2014-07-16 10:55:17
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回帖置顶 ( 共有1个 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-07-17 10:11:51
gyesang: 回帖置顶 2014-07-18 15:36:39
模板为4kd，长片段PCR为好。

长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求

2014-7-11

3kd-20kd的DNA片段适用长片段PCR扩增。
1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了20kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)
其他同普通PCR。
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19楼2014-07-17 00:08:05
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
董庄青年: 金币+1 2014-07-16 12:08:46
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 13:03:16
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数偏少，可以设置到30-35 cycles。
如果你进行长片段扩增的话，有专门的长片段试剂盒，扩增效率很高的。
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rainwater
2楼2014-07-16 11:35:14
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代德艳

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉循环数有点少
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6楼2014-07-16 15:45:37
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梦想1995

新虫 (初入文坛)
★
感谢参与，应助指数 +1
董庄青年: 金币+1, ★有帮助 2014-07-16 17:30:07
本帖内容被屏蔽
10楼2014-07-16 17:20:22
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rodickholm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
董庄青年: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-07-16 20:11:28
引用回帖:
12楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-16 19:08:53
苦恼中  求大神们高见

切胶回收，用回收产物二次pcr

[ 发自小木虫客户端 ]
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13楼2014-07-16 19:56:40
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rodickholm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-16 20:11:10
感谢你的回帖   
  目的条带那么浅切胶回收量太少了吧...

回收低，再pcr就多了

[ 发自小木虫客户端 ]
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15楼2014-07-16 20:24:48
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
董庄青年: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2014-07-17 09:27:20
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-17 10:11:32
滚环PCR直接扩载体？做定点突变的吧。。
1.引物不够长，你这种PCR退火温度至少得60甚至65度以上，必须要保证你的引物和模板的高特异性，一般的说明书上都建议两步PCR。温度越低引物二聚体越多。
2.你的酶得换换了，延伸速度太慢，至少换30s/1kb的保真酶，一般的酶不能胜任这个PCR
3.你的这个PCR后期转化真正需要的并不是上面那条带，而是带缺刻的环状DNA，上面那条带属于线性指数扩增的二联体引物条带，越多越不利于你后期转化后的筛选。
4.你扩完是不是需要用甲基化识别位点的限制性内切酶处理模板啊？处理完不要纯化了，适当稀释后直接转化就好，测序的时候多挑几个转化子，会有引物二联体，甚至三联体引物的假阳性出现。
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大家相互帮助哈
20楼2014-07-17 03:59:40
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
11楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-16 17:29:45
首先  谢谢你的回答
也试过了 分别把第一副图中的PCR产物1ul作为模板   稀释10倍取2ul作为模板  其他条件不变  做二次PCR出现涂抹带  都没有目的条带...

涂抹带  说明 模板太多了、你稀释50或100倍后，加2ul作为模板试试
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22楼2014-07-17 08:25:32
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
更正：
我总是习惯性地把PCR扩增的DNA片段的长度单位“kb”误写为“kd”，两个概念差距甚远，很不好意思。
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26楼2014-07-17 11:06:56
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-18 10:29:22
看你的引物，正反向是互补的，是做定点突变吗？如果做定点突变的话，给你推荐一个在线设计软件，我做过多次点突变，用这个软件设计的引物扩的都很好。QuikChange Primer Design。链接：https://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp
另外，如果做定点突变的话，需要采用保真性高的KOD或者Pfu酶，Taq酶做定点突变不行的
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rainwater
35楼2014-07-17 16:36:57
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lippi21

铁杆木虫 (正式写手)
退火温度降低到55度，引物量减少到1ul，模板量加到2ul。
循环数30。
不行的话将上次的PCR产物分别稀释100、1000、10000 倍当模板再试一次。条件不变。
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42楼2014-07-18 08:47:09
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普通回帖

董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-16 11:35:14
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数 ...

哦  我的引物是同源引物   形成二聚体是正常的  而且我的目的条带是4kd就是整个质粒的长度   以前能p出来  最近就是不行
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3楼2014-07-16 12:22:21
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-16 11:35:14
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数 ...

引物1：5’-GGAGTTGATGGTGCAGGAAATGAATTG-3’
引物2：5’-CAATTCATTTCCTGCACCATCAACTCC-3’
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4楼2014-07-16 14:14:47
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
大神们 求解啊
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5楼2014-07-16 14:36:51
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 代德艳 at 2014-07-16 15:45:37
感觉循环数有点少

30个循环也试过 基本没什么变化啊   晕闷
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7楼2014-07-16 15:59:23
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代德艳

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-16 15:59:23
30个循环也试过 基本没什么变化啊   晕闷...

这个引物也是以前用过的？
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8楼2014-07-16 16:14:49
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 代德艳 at 2014-07-16 16:14:49
这个引物也是以前用过的？...

这个是以前p出来的   后来就怎么也p不出来了 奇了怪了
PCR目的条带太弱 并无非特异性条带  怎样改进可以使目的产物的量加大-1
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9楼2014-07-16 16:51:43
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