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hihe99

银虫 (小有名气)

[求助] race pcr问题，没有特异性条带

生手做race，5'时两次扩增，跑出来的图没有特异性产物，巢氏扩增的第二次结果更是奇怪，都从胶孔开始弥散了，求前辈们指点
图中，1，2，3是第一次扩增，3是阴性对照
4～8是第二次扩增，8是阴性对照，4，6模板分别是1，2；5，7模板是稀释20倍的1，2
race pcr问题，没有特异性条带
1.jpg
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1楼 2013-08-30 11:38:14
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hihe99

银虫 (小有名气)
求助啊，大神们帮忙啊
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2楼2013-09-03 19:42:37
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grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-04 15:22:40
hihe99: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-09-05 14:40:44
首先建议你用试剂盒自带的验证系统看看是不是整个系统工作正常.因为你没说用的是什么试剂盒,不同的试剂盒效率也不近相同,碰到问题的时候验证一下系统会比较有信心.3''RACE好做,但是5'RACE对扩增用的taq酶要求也很高,你要确保系统每一部分工作都正常.
其次要看看反转录本身有没有问题.可以拿个长点的基因来验证一下.
再次是不是你设计的引物不是太合适作RACE? 或者说你设计的退货温度比较低而实际用的退货温度比较高?如果有3'引物,并且和5'的引物有overlap, 可以扩增一下,看看引物是否可用,反转录是否成功.
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3楼2013-09-04 08:14:02
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hihe99

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by grape_vine at 2013-09-04 09:14:02
首先建议你用试剂盒自带的验证系统看看是不是整个系统工作正常.因为你没说用的是什么试剂盒,不同的试剂盒效率也不近相同,碰到问题的时候验证一下系统会比较有信心.3''RACE好做,但是5'RACE对扩增用的taq酶要求也很高 ...

终于有回复了，谢谢！
我没有用专门的试剂盒，参考1篇文章做的，3'能扩出来，但是带总是很弱，请问是什么原因啊，
按你的建议，我先验证下反转录吧
谢谢！
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4楼2013-09-04 13:49:07
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hihe99

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by grape_vine at 2013-09-04 09:14:02
首先建议你用试剂盒自带的验证系统看看是不是整个系统工作正常.因为你没说用的是什么试剂盒,不同的试剂盒效率也不近相同,碰到问题的时候验证一下系统会比较有信心.3''RACE好做,但是5'RACE对扩增用的taq酶要求也很高 ...

另外，后面的我感觉有产物生成，但是产物从胶孔往下弥散，大概是什么原因呢
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5楼2013-09-04 14:00:04
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grape_vine

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hihe99 at 2013-09-04 14:00:04
另外，后面的我感觉有产物生成，但是产物从胶孔往下弥散，大概是什么原因呢...

这个说的太悬乎了.不清楚啥情况.
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6楼2013-09-04 15:59:49
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grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
hihe99: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-05 14:40:52
引用回帖:
4楼: Originally posted by hihe99 at 2013-09-04 13:49:07
终于有回复了，谢谢！
我没有用专门的试剂盒，参考1篇文章做的，3'能扩出来，但是带总是很弱，请问是什么原因啊，
按你的建议，我先验证下反转录吧
谢谢！...

3'我建议就用clontech的试剂盒里面的引物,自己合成了做, 效果好的很.每啥问题
不知道你参考的啥文章,慢慢找问题吧.3' 扩增出来应该是很强才对.因为3' 是反转录效率最高的地方,一般5' 多半是由于反转录不完全等原因,导致不容易成功.3' 就没这个问题.
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7楼2013-09-04 16:01:33
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magy2006

木虫 (著名写手)
模板浓度太高啦，稀释一百倍再扩增，30个循环差不多够了
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8楼2013-09-22 13:53:53
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