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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR的cDNA不能扩增出目的条带，只有内参基因能扩增出来
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yangqi

金虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR的cDNA不能扩增出目的条带，只有内参基因能扩增出来

大家好！
我近期在做RT-PCR，一共有四个模板，来源于同一个细菌。内参选择的是16sRNA，另外还选择了两对目的基因。
提取RNA后，经DNA酶消化后，以反转录后得到cDNA为模板，用普通PCR扩增，但是只有16sRNA是在每个样本中都可以得到的，目的基因在其中的两个样本中无法得到，不知道是什么原因。求各位高手解惑！
这是我所提RNA的图片，其中第1、2、3泳道为1、2、3样本，后面两个泳道为第4个样本。

逆转录后得到的图如下，基因分别为16sRNA、目的基因1和2（从右到左）。泳道有点糊的是DNA做的阳参。
后面我又重新做了一次，结果更差了

希望大家批评指正，感激不尽！

第二次的结果



第一次的结果



RNA检测的结果
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人生，只有坚强，才能美好！
1楼2012-08-10 10:30:00
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhqu1234

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-08-10 13:53:30
yangqi: 金币+100, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2012-08-10 16:04:25
1.楼主的基因是否为低拷贝基因？我曾经克隆一个低拷贝基因，提了50个RNA样品，只有3个扩增出来了。楼主扩增不出可能跟所提样品太少有关系。
2.楼主的基因是否是较长片段？由于RNA降解导致cDNA不完整，如果片段较长也可能扩增不出来，建议楼主分段设计引物进行拼接。
3.建议使用活性较高的taq酶进行pcr，有些高保真的酶就是扩不出来。
4.建议楼主在目的基因内部（最好是3‘端）设计较短序列的一对引物，对你这三个样品进行pcr看看。
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2楼2012-08-10 12:50:07
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zhqu1234

银虫 (初入文坛)
PCR mix得看公司了，一般越贵的保真性越好，活性反而低。我们平常pcr用天根的mix，活性非常高，但是错配率高达1/100。好多进口货扩增不出来的，他都能扩出来。
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4楼2012-08-10 16:12:47
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yangqi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhqu1234 at 2012-08-10 12:50:07
1.楼主的基因是否为低拷贝基因？我曾经克隆一个低拷贝基因，提了50个RNA样品，只有3个扩增出来了。楼主扩增不出可能跟所提样品太少有关系。
2.楼主的基因是否是较长片段？由于RNA降解导致cDNA不完整，如果片段较长 ...

1.我的这两个基因，按照质谱结果来说，应该是高拷贝的，但是为什么在最有可能拷贝出的样本里却拷贝不出来，不能理解。
2.片段大小在100bp左右吧，我现在也怀疑由于用的是随机引物，不知道目的片段的反转录了没有。
3.我用的是mix做的PCR，不知有没有问题？
4.这个建议很好，谢谢，我试试看。
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3楼2012-08-10 16:08:39
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yangqi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhqu1234 at 2012-08-10 16:12:47
PCR mix得看公司了，一般越贵的保真性越好，活性反而低。我们平常pcr用天根的mix，活性非常高，但是错配率高达1/100。好多进口货扩增不出来的，他都能扩出来。

我有一个小小疑问，为什么在菌体的衰亡期，反而那两个基因都很亮呢？
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5楼2012-08-10 16:28:29
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zhqu1234

银虫 (初入文坛)
我觉得这与目的基因表达的时空特异性有关吧，RT多多少少能反映基因表达的差异的。
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6楼2012-08-10 17:15:24
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yangqi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhqu1234 at 2012-08-10 17:15:24
我觉得这与目的基因表达的时空特异性有关吧，RT多多少少能反映基因表达的差异的。

可是这与我的质谱数据是完全相反的
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7楼2012-08-10 17:32:30
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zhqu1234

银虫 (初入文坛)
正常正常，RTPCR只能“多多少少”反映基因表达的差异，结果不一定准确，建议楼主多做几次重复或者做个real-time PCR看看，如果还是相反地结果，就得好好考虑了。我们实验室也曾做出过real-time PCR和western数据完全相反地结果，后来发现是有原因的，发了大paper。
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8楼2012-08-10 17:48:43
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yangqi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhqu1234 at 2012-08-10 17:48:43
正常正常，RTPCR只能“多多少少”反映基因表达的差异，结果不一定准确，建议楼主多做几次重复或者做个real-time PCR看看，如果还是相反地结果，就得好好考虑了。我们实验室也曾做出过real-time PCR和western数据完全 ...

借你吉言，真希望是这样，我做过两次重复了，准备再做试试看。和WB比较看看吧，大paper不敢想，只想知道原因就好了。
非常感谢你的帮助！
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9楼2012-08-11 09:18:10
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vickie20

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhqu1234 at 2012-08-10 17:48:43
正常正常，RTPCR只能“多多少少”反映基因表达的差异，结果不一定准确，建议楼主多做几次重复或者做个real-time PCR看看，如果还是相反地结果，就得好好考虑了。我们实验室也曾做出过real-time PCR和western数据完全 ...

能把你那篇文章题目发给我吗，我想看看，谢谢了~
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10楼2012-08-12 21:32:52
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