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yangqi金虫 (小有名气)
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RT-PCR的cDNA不能扩增出目的条带，只有内参基因能扩增出来
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大家好！ 我近期在做RT-PCR，一共有四个模板，来源于同一个细菌。内参选择的是16sRNA，另外还选择了两对目的基因。 提取RNA后，经DNA酶消化后，以反转录后得到cDNA为模板，用普通PCR扩增，但是只有16sRNA是在每个样本中都可以得到的，目的基因在其中的两个样本中无法得到，不知道是什么原因。求各位高手解惑！ 这是我所提RNA的图片，其中第1、2、3泳道为1、2、3样本，后面两个泳道为第4个样本。 逆转录后得到的图如下，基因分别为16sRNA、目的基因1和2（从右到左）。泳道有点糊的是DNA做的阳参。 后面我又重新做了一次，结果更差了 希望大家批评指正，感激不尽！  第二次的结果  第一次的结果  RNA检测的结果 |
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yangqi
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3楼2012-08-10 16:08:39
【答案】应助回帖
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1.楼主的基因是否为低拷贝基因？我曾经克隆一个低拷贝基因，提了50个RNA样品，只有3个扩增出来了。楼主扩增不出可能跟所提样品太少有关系。 2.楼主的基因是否是较长片段？由于RNA降解导致cDNA不完整，如果片段较长也可能扩增不出来，建议楼主分段设计引物进行拼接。 3.建议使用活性较高的taq酶进行pcr，有些高保真的酶就是扩不出来。 4.建议楼主在目的基因内部（最好是3‘端）设计较短序列的一对引物，对你这三个样品进行pcr看看。 |
2楼2012-08-10 12:50:07
4楼2012-08-10 16:12:47
yangqi
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5楼2012-08-10 16:28:29