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knighteva

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1楼 2012-04-24 16:43:52
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, good 2012-04-25 13:30:44
设计引物回来Tm值是多少，一般都以那个为参考，退火温度比Tm值低5-15度。但是像你说的，不同温度都有很多条带的话， 可能是你引物设计的不好，特异性差。我以前遇到过这种状况，后来重新设计一对引物就好了。
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未来不是梦
2楼2012-04-24 19:28:01
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changes

木虫 (正式写手)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-25 13:31:08
这个许多人都遇到过，我也碰到过。简单分析一下：
1.你的基因组DNA质量怎么样？提取多久了？浓度大约多少？
2.材料是二倍体的还是多倍体的？同源材料、异源材料？
3.ORF多大的片段？可以选择的引物位点多吗？
4.PCR时换一个适合高GC含量的Taq酶试试，或者利用Pfu Taq酶。
5.Tm值可能尚需摸索
6.以上方法都试过了还不行的话，就换一下引物吧。(可以结合同源基因或同一类的基因的基因组序列)
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3楼2012-04-24 20:38:47
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很有可能是你的引物特异性不够，这种事情是很常见的，你可以把你的引物和整个基因组序列做一下序列对比或者BLAST一下，可以找找是不是这个原因。
还有就是适当提高退火温度，提高引物特异性，呵呵，都可以试试了，祝顺利。
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4楼2012-04-25 13:34:19
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 恩，鼓励提供有价值的应助哦 2012-04-25 13:58:18
我之前也扩增过DNA，感觉要注意：
1.DNA的质量一定要过关，不要有降解
2.设计引物的时候，一定要看亲缘关系近的物种该基因的内含子和外显子分布情况以及长短，可以从起始密码子开始往后，如果没有适合的特异性引物，可以稍稍再往后设计，下游也是同理，如果不是很确定的话，就可以多设计一对上下游，之后可以做个巢式PCR，引物的退火温度尽量高点。
3.一般你引物特异性比较好的话，扩出来的是一条带。
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5楼2012-04-25 13:54:24
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knighteva

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6楼2012-04-28 08:33:38
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knighteva

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7楼2012-04-28 08:34:48
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knighteva

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8楼2012-04-28 08:35:39
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cute_man

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
knighteva: 金币+1, ★有帮助 2013-05-09 09:35:32
如果我没猜错，你应该克隆的是真核生物的基因，cDNA和基因组DNA相比缺少了内含子片段，我这边有个同学也遇到了这种情况，我觉得可能还是引物问题，以cDNA设计的引物在基因组DNA上扩增，可能引物正好搭在内含子片段上，那肯定影响退火，建议多设几段引物，只要扩增出目的片段，不管长短，就可以想其他办法再拿到基因组上的全长
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9楼2013-05-08 09:56:50
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