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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助】用cDNA的ORF序列以基因组DNA为模板 做PCR 为何P不出其对应的基因组序列?
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knighteva

禁虫 (初入文坛)
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1楼2012-04-24 16:43:52
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knighteva

禁虫 (初入文坛)
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6楼2012-04-28 08:33:38
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, good 2012-04-25 13:30:44
设计引物回来Tm值是多少，一般都以那个为参考，退火温度比Tm值低5-15度。但是像你说的，不同温度都有很多条带的话， 可能是你引物设计的不好，特异性差。我以前遇到过这种状况，后来重新设计一对引物就好了。
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未来不是梦
2楼2012-04-24 19:28:01
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changes

木虫 (正式写手)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-25 13:31:08
这个许多人都遇到过，我也碰到过。简单分析一下：
1.你的基因组DNA质量怎么样？提取多久了？浓度大约多少？
2.材料是二倍体的还是多倍体的？同源材料、异源材料？
3.ORF多大的片段？可以选择的引物位点多吗？
4.PCR时换一个适合高GC含量的Taq酶试试，或者利用Pfu Taq酶。
5.Tm值可能尚需摸索
6.以上方法都试过了还不行的话，就换一下引物吧。(可以结合同源基因或同一类的基因的基因组序列)
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2012-04-24 20:38:47
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很有可能是你的引物特异性不够，这种事情是很常见的，你可以把你的引物和整个基因组序列做一下序列对比或者BLAST一下，可以找找是不是这个原因。
还有就是适当提高退火温度，提高引物特异性，呵呵，都可以试试了，祝顺利。
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4楼2012-04-25 13:34:19
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