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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 同源比对设计简并引物PCR产物测序不符！
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)

[求助] 同源比对设计简并引物PCR产物测序不符！

找亲缘关系相近的生物做基因比对，找出基因保守区，根据保守区设计合成简并引物，PCR扩增得到单一的条带，拿去测序，测序结果与之前比对的保守区域相似度极低！！都设计了10多对简并引物，反复PCR切胶回收测序，做了半年多了。眼看着即将毕业却没有什么可用的结果。急呀-----！  想请各位大仙帮帮忙，想想办法。俺看是哪些地方的问题！！！谢谢了！！！  

师兄说之前从没有出现过这种情况，说的我心里发毛，不知该怎么办了！！！！

[ Last edited by wushuwei1104 on 2012-4-12 at 13:06 ]
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勤能补拙
1楼2012-04-12 13:04:48
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-12 13:51:17
楼主可以说清楚点吗？你设计了10对引物，每次都扩出片段出来了吗？还是部分扩出来了，最后拿去测序不对？测序的结果之间比对了吗？

引物的简并度是多少，尽量不要太高，还有RNA的质量一定要好。
如果实验没有什么错误的话，考虑一下基因的丰度问题，是不是最好用什么处理一下，诱导一下表达，再克隆基因？
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2楼2012-04-12 13:12:52
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+3, 应助指数+1, Good！ 2012-04-12 23:44:51
wushuwei1104: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-04-13 13:16:35
引用回帖:
3楼: Originally posted by wushuwei1104 at 2012-04-12 20:35:59:
是10对引物，，每次扩增都有条带，有的是但一条带且与预期大小相符，有些是有杂带，但我每次测序都是选取和预期的片段大小相符的去测序，结果都不对。同一引物扩增出来的片段经测序后比对，几乎完全相同。不同引 ...

如果是你的条带的话，菌液应该是非常亮的。注意引物的简并度不能很高，最好128以内吧。你说每次扩增都有条带，尽量找退火温度高的引物的进行扩增（如果是10条基因的话，可以之间组合一下试试），可以做个降落式PCR，前几个循环退火温度高些，然后再慢慢降低。
  试验设计方面，一定要搞清楚，这个基因在你的材料中有没有表达。如果还是赶着要毕业的话，还是最好同时扩增其他基因，不要把所有的希望都寄托在一个基因上面。
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wushuwei1104
4楼2012-04-12 21:13:57
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普通回帖

wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiazhiwuxie at 2012-04-12 13:12:52:
楼主可以说清楚点吗？你设计了10对引物，每次都扩出片段出来了吗？还是部分扩出来了，最后拿去测序不对？测序的结果之间比对了吗？

引物的简并度是多少，尽量不要太高，还有RNA的质量一定要好。
如果实验没有 ...

是10对引物，，每次扩增都有条带，有的是但一条带且与预期大小相符，有些是有杂带，但我每次测序都是选取和预期的片段大小相符的去测序，结果都不对。同一引物扩增出来的片段经测序后比对，几乎完全相同。不同引物之间比对，相似度低。
现在师兄也是想到了基因丰度的问题，硕士有可能这个基因还没有表达，或表达量不太高，所以可能扩增出杂带。但是应用NCBI里的BLAST搜索那些测序的序列，没有与之相似的基因报道。这不是要愁死人了吗！！！！
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勤能补拙
3楼2012-04-12 20:35:59
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiazhiwuxie at 2012-04-12 21:13:57:
如果是你的条带的话，菌液应该是非常亮的。注意引物的简并度不能很高，最好128以内吧。你说每次扩增都有条带，尽量找退火温度高的引物的进行扩增（如果是10条基因的话，可以之间组合一下试试），可以做个降落式P ...

谢谢这位仁兄了，回头我再试试，非常感谢！！！
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勤能补拙
5楼2012-04-13 13:15:39
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
看到楼主的帖子，有种同命相连的感觉。不知楼主做出来了没有，我也想设计兼并引物，不知楼主能否给些建议？
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nothing isimpossible
6楼2012-06-08 23:37:11
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-06-08 23:37:11
看到楼主的帖子，有种同命相连的感觉。不知楼主做出来了没有，我也想设计兼并引物，不知楼主能否给些建议？

还没做出来呢！  之前设计兼并引物 只P出一小段序列。这个也没什么可行性建议，毕竟自己没做出来！
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勤能补拙
7楼2012-06-09 08:32:22
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
那请问你设计的兼引物的简并度大概多少？你是用primer5设计的吗？
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nothing isimpossible
8楼2012-06-09 16:53:34
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-06-09 16:53:34
那请问你设计的兼引物的简并度大概多少？你是用primer5设计的吗？

是的，简并度大小不一呀！  批出来的那个引物的简并度很低，还是建议选择简并度低的引物试试看吧！！
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勤能补拙
9楼2012-06-09 23:16:49
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wushuwei1104 at 2012-06-09 23:16:49
是的，简并度大小不一呀！  批出来的那个引物的简并度很低，还是建议选择简并度低的引物试试看吧！！...

请问设计兼并引物参考NDA序列还是氨基酸序列？因为我将参考的几条DNA序列进行比对，发现在对应的保守序列中对应的氨基酸都是同一种密码子决定的，如果引物中使用这种密码子，兼并度会低很多，但如果将一条氨基酸序列输入primer 5，再翻译成DNA。这样在保守区的设计的兼并引物兼并度很高。
我第一次设计兼并引物，实验室也没人设计过，只是从网上看到一些教程学的。这个问题一直困扰着我，还请大侠指教。
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nothing isimpossible
10楼2012-06-10 15:35:07
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