应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 同源比对设计简并引物PCR产物测序不符！
51/1返回列表
查看: 2187  |  回复: 10
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

wushuwei1104

银虫 (小有名气)

[求助] 同源比对设计简并引物PCR产物测序不符！

找亲缘关系相近的生物做基因比对，找出基因保守区，根据保守区设计合成简并引物，PCR扩增得到单一的条带，拿去测序，测序结果与之前比对的保守区域相似度极低！！都设计了10多对简并引物，反复PCR切胶回收测序，做了半年多了。眼看着即将毕业却没有什么可用的结果。急呀-----！  想请各位大仙帮帮忙，想想办法。俺看是哪些地方的问题！！！谢谢了！！！  

师兄说之前从没有出现过这种情况，说的我心里发毛，不知该怎么办了！！！！

[ Last edited by wushuwei1104 on 2012-4-12 at 13:06 ]
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

测序相关问题

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
勤能补拙
1楼2012-04-12 13:04:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiazhiwuxie at 2012-04-12 13:12:52:
楼主可以说清楚点吗？你设计了10对引物，每次都扩出片段出来了吗？还是部分扩出来了，最后拿去测序不对？测序的结果之间比对了吗？

引物的简并度是多少，尽量不要太高，还有RNA的质量一定要好。
如果实验没有 ...

是10对引物，，每次扩增都有条带，有的是但一条带且与预期大小相符，有些是有杂带，但我每次测序都是选取和预期的片段大小相符的去测序，结果都不对。同一引物扩增出来的片段经测序后比对，几乎完全相同。不同引物之间比对，相似度低。
现在师兄也是想到了基因丰度的问题，硕士有可能这个基因还没有表达，或表达量不太高，所以可能扩增出杂带。但是应用NCBI里的BLAST搜索那些测序的序列，没有与之相似的基因报道。这不是要愁死人了吗！！！！
赞一下 回复此楼
勤能补拙
3楼2012-04-12 20:35:59
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-12 13:51:17
楼主可以说清楚点吗？你设计了10对引物，每次都扩出片段出来了吗？还是部分扩出来了，最后拿去测序不对？测序的结果之间比对了吗？

引物的简并度是多少，尽量不要太高，还有RNA的质量一定要好。
如果实验没有什么错误的话，考虑一下基因的丰度问题，是不是最好用什么处理一下，诱导一下表达，再克隆基因？
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2012-04-12 13:12:52
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+3, 应助指数+1, Good！ 2012-04-12 23:44:51
wushuwei1104: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-04-13 13:16:35
引用回帖:
3楼: Originally posted by wushuwei1104 at 2012-04-12 20:35:59:
是10对引物，，每次扩增都有条带，有的是但一条带且与预期大小相符，有些是有杂带，但我每次测序都是选取和预期的片段大小相符的去测序，结果都不对。同一引物扩增出来的片段经测序后比对，几乎完全相同。不同引 ...

如果是你的条带的话，菌液应该是非常亮的。注意引物的简并度不能很高，最好128以内吧。你说每次扩增都有条带，尽量找退火温度高的引物的进行扩增（如果是10条基因的话，可以之间组合一下试试），可以做个降落式PCR，前几个循环退火温度高些，然后再慢慢降低。
  试验设计方面，一定要搞清楚，这个基因在你的材料中有没有表达。如果还是赶着要毕业的话，还是最好同时扩增其他基因，不要把所有的希望都寄托在一个基因上面。
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

wushuwei1104
4楼2012-04-12 21:13:57
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wushuwei1104

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiazhiwuxie at 2012-04-12 21:13:57:
如果是你的条带的话，菌液应该是非常亮的。注意引物的简并度不能很高，最好128以内吧。你说每次扩增都有条带，尽量找退火温度高的引物的进行扩增（如果是10条基因的话，可以之间组合一下试试），可以做个降落式P ...

谢谢这位仁兄了，回头我再试试，非常感谢！！！
赞一下 回复此楼
勤能补拙
5楼2012-04-13 13:15:39
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭