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wushuwei1104银虫 (小有名气)
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[求助]
同源比对设计简并引物PCR产物测序不符！
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找亲缘关系相近的生物做基因比对，找出基因保守区，根据保守区设计合成简并引物，PCR扩增得到单一的条带，拿去测序，测序结果与之前比对的保守区域相似度极低！！都设计了10多对简并引物，反复PCR切胶回收测序，做了半年多了。眼看着即将毕业却没有什么可用的结果。急呀-----！ 想请各位大仙帮帮忙，想想办法。俺看是哪些地方的问题！！！谢谢了！！！ 师兄说之前从没有出现过这种情况，说的我心里发毛，不知该怎么办了！！！！ [ Last edited by wushuwei1104 on 2012-4-12 at 13:06 ] |
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如果是你的条带的话，菌液应该是非常亮的。注意引物的简并度不能很高，最好128以内吧。你说每次扩增都有条带，尽量找退火温度高的引物的进行扩增（如果是10条基因的话，可以之间组合一下试试），可以做个降落式PCR，前几个循环退火温度高些，然后再慢慢降低。 试验设计方面，一定要搞清楚，这个基因在你的材料中有没有表达。如果还是赶着要毕业的话，还是最好同时扩增其他基因，不要把所有的希望都寄托在一个基因上面。 |
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