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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！PCR扩增不出全长DNA序列怎么办？
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shenhaiwang

金虫 (小有名气)

[求助] 求助！PCR扩增不出全长DNA序列怎么办？

我在做PCR时，所用引物是根据整个阅读框设计的，扩增出来的DNA理论上应该是1000bp左右，但是扩增出来的只有171bp的DNA片段，从电泳图上看，扩增条带很亮，特异性也很好；测序后发现此扩增片段跟我所要全长序列的3'端能够完全比对，并且包含下游引物序列。貌似上游引物没有扩增出任何条带，只是下游引物的单引物扩增，多次改变退火温度，结果依然如此，我下一步该怎么办呢？急切希望各位虫友出手相助，指点迷津，吾感激不尽！
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1楼2011-05-08 17:03:37
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bbwalkman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 鼓励新虫交流 2011-05-08 19:47:11
shenhaiwang(金币+3): 引物是用软件设计的，Tm才46℃，比较低，但是我做PCR时已经试过45℃的退火温度了，条带还跟原来一样。。。 2011-05-08 20:18:53
shenhaiwang(金币+1): 2011-05-09 12:51:22
内容已删除
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2楼2011-05-08 19:03:56
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倔强的投手

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 同感 2011-05-08 19:47:22
shenhaiwang(金币+2): 谢谢！ 2011-05-08 20:19:31
估计是引物的问题吧
重新设计引物
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3楼2011-05-08 19:15:03
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-05-09 07:59:24
shenhaiwang(金币+2): 嗯，可能是。谢谢！我在合成之前对引物进行了评价，都不是很理想，最后选了一个相对比较好的，拿去合成了。 2011-05-09 09:31:57
感觉是你引物特异性的问题，还是重新设计引物吧，先把引物放在oligo6和引物BLAST上评价一下在合成
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
4楼2011-05-08 22:40:12
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小小_木虫

木虫 (小有名气)
引物方向是不是都是朝一个方向走的？
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5楼2011-05-09 08:51:23
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shenhaiwang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 小小_木虫 at 2011-05-09 08:51:23:
引物方向是不是都是朝一个方向走的？

谢谢你，不过引物的方向我确定没有问题的。
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6楼2011-05-09 12:53:25
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

shenhaiwang(金币+2): 2011-05-09 17:11:57
如果方便的话能发下引物，和基因名让我看看吗?
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7楼2011-05-09 13:37:13
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shenhaiwang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2011-05-09 13:37:13:
如果方便的话能发下引物，和基因名让我看看吗?

引物：
上游：TACGGCGTTTGTTAGAGATATCATAG
下游：TATAACTATGGCTGAAGAACTTTTC
基因是章鱼精氨酸激酶
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8楼2011-05-09 17:10:28
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 热心 2011-05-10 12:14:01
引用回帖:
Originally posted by shenhaiwang at 2011-05-09 17:10:28:
引物：
上游：TACGGCGTTTGTTAGAGATATCATAG
下游：TATAACTATGGCTGAAGAACTTTTC
基因是章鱼精氨酸激酶

可能是引物特异性不好，从新设计引物试下。
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9楼2011-05-10 08:52:25
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shenhaiwang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2011-05-10 08:52:25:
可能是引物特异性不好，从新设计引物试下。

嗯，好的。谢谢你！
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10楼2011-05-10 10:36:23
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