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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 真菌ITS序列PCR扩增 求助
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bear0329

金虫 (正式写手)

[求助] 真菌ITS序列PCR扩增 求助

提取到土壤DNA后进行真菌ITS序列PCR扩增，用的引物是ITS1F/ITS4R
做了温度梯度PCR，退火温度从45℃——65℃，检测结果显示，非特异性条带多，目的产物产量不高，见下图
该如何优化PCR体系和程序？请各位虫友提供宝贵意见，先谢谢啦！
PCR体系：
总体积               30
10×buffer                      3
dNTP                             1.5
引物                  1
taq EX                             0.3
BSA                                 0.2
模板                   1
水                     22

程序：
94℃             4min
94℃             1min
45℃~65℃   45s
72℃             90s
72℃             10min
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以马内利！
1楼2011-07-02 22:47:20
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bear0329

金虫 (正式写手)
自己顶下
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以马内利！
2楼2011-07-04 10:01:44
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-07-04 18:03:59
bear0329(金币+2): 我是做多态性分析的，不是做鉴定，里面应该有很多的ITS序列，谢谢啊 2011-07-04 22:01:24
bear0329(金币+1): 2011-07-06 15:13:16
你是不是要做菌种的ITS序列的鉴定呢？如果是的话，我把我做过的告诉你，如果不是的就算了哇~
ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’
ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’
PCR Amplification reaction system（50μl）
ddH2O                        38.5μl
10×buffer with MgCl2        5.0μl
dNTPs(2.5mM)        1.0μl
Primer5’                        2.0μl
Primer3’                        2.0μl
DNA template        1.0μl
Taq DNA ploymerase(5U/μl)        0.5μl

反应程序如下：
94℃  for   5 minutes   denaturalization
94℃  for  45 seconds   denaturation
52℃  for  45 seconds   annealing
72℃  for   1min30sec   extension  2  35
72℃  for  10 minutes  final extension
大概500bp左右
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3楼2011-07-04 16:17:18
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): 鼓励 2011-07-05 00:31:55
楼主提取土壤样品的DNA，里面的微生物是非常丰富的，当然也是含有多种真菌的，使用真菌通用引物来扩增，照理说应该得到多个扩增产物，他们的ITS的长度相互之间不会变化太大，所以跑DNA电泳的时候可能会在相近的地方有多条带。（现在论坛不能上传和下载文件，连带着看不到楼主贴出来的图。）所以不存在非特异性扩增的说法。理应是多条带的，只得到一条带才奇怪，无论是做什么退火温度梯度，结果都不会有实质性改变。

你的PCR体系总体积是29微升，引物只有1微升，是不是想写正反向引物各1微升？体系和我用的一样，程序也没有任何问题，除了退火温度之外，其余的和我的一样。

beautybanana用的是ITS5，其实也没问题，大同小异。ITS1和5都是在18S上的，ITS4在28S上，ITS1和4或者5和4都可以用，扩增得到的可变区都是完整的两个。至于长度就难说了，各种不同种属的真菌得到的长度可能会不同，不局限于500bp。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-07-04 19:06:39
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bear0329

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-04 19:06:39:
楼主提取土壤样品的DNA，里面的微生物是非常丰富的，当然也是含有多种真菌的，使用真菌通用引物来扩增，照理说应该得到多个扩增产物，他们的ITS的长度相互之间不会变化太大，所以跑DNA电泳的时候可能会在相近的地 ...

谢谢你啊，我是做一个多态性分析的，我要得到ITS序列后去酶切，然后进行多态性分析，我是不是要把所有扩增出的条带回收后分析呢？
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以马内利！
5楼2011-07-04 22:03:25
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 厉害厉害！ 2011-07-05 00:31:39
bear0329(金币+2): 谢谢你的建议啊~ 2011-07-05 07:57:12
bear0329(金币+1): 2011-07-06 15:13:32
被我猜中了，你发帖的时候我就在想你的意图，现在果然没猜错。

由于你的序列长度相差可能不大，跑电泳极难分得开，所以不能回收。再说了，即使是分得很开，也存在两个菌株的扩增产物长度完全相同的隐患，所以是得不到单一产物的。

但是你可以将扩增产物都回收（保持产物的多样性才能达到你分析多样性的目的），全部与载体连接，得到一批含有外源片段的克隆子，转化载体到宿主内（一般选用大肠杆菌），涂板得到单菌落，这就是可能含有各不相同的ITS序列的克隆子了，将这些克隆子分别培养提取质粒送测序，就能得到很多菌株的ITS序列，进行多样性分析了。

当然这会耗费一笔钱，但这是必须付出的代价。
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6楼2011-07-04 23:20:18
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hc1027

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-04 23:20:18:
被我猜中了，你发帖的时候我就在想你的意图，现在果然没猜错。

由于你的序列长度相差可能不大，跑电泳极难分得开，所以不能回收。再说了，即使是分得很开，也存在两个菌株的扩增产物长度完全相同的隐患，所以是 ...

你好！
请问下：如果用ITS1和4做完真菌的PCR之后，不切胶直接做DGGE的话，然后再切胶拿去测序，这样分析真菌多样性是不是不太准确呢？
谢谢
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7楼2011-07-07 11:46:39
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
Originally posted by hc1027 at 2011-07-07 11:46:39:
你好！
请问下：如果用ITS1和4做完真菌的PCR之后，不切胶直接做DGGE的话，然后再切胶拿去测序，这样分析真菌多样性是不是不太准确呢？
谢谢

不好意思我没做过DGGE，只是有什么想法就说也不够负责，所以只能不好意思了。
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8楼2011-07-07 12:30:33
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天豪家园总裁

新虫 (初入文坛)
真菌pcr引物选择，有哪位朋友熟悉，万分感谢
最近在做小型真菌分子相关实验，对同一属不同种的真菌进行比较，用引物进行pcr扩增，使用了its引物，但是效果不太明显。有哪位朋友对真菌pcr扩增引物选择比较了解，能介绍一下吗？万分感谢
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9楼2013-07-06 18:02:41
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nuraliya

新虫 (初入文坛)
你们好！我最近做了真菌PCR，用的是ITS1和4，但是PCR结果重叠峰，这怎么回事儿？该怎么办，帮我解决一下亲爱的们。
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10楼2014-12-04 17:49:52
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