| 查看: 4569 | 回复: 30 | ||||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||||
老夏853铁杆木虫 (著名写手)
|
[交流]
求助 土壤基因组 PCR 扩增问题 已有15人参与
|
|||||
|
跟很多人一样 做的是土壤微生物多样性 这里，我觉得有一个很大的瓶颈 就是提取基因组之后的PCR扩增问题。因为后面的所有分子水平的分析都建立在PCR 扩增的基础上。可是 我做了很久，这个扩增效果总是不理想。 在此发帖，希望做类似工作的 能够将自己在实验过程中的心得一一列举出来 不论什么因素 只要是自己觉得影响pCR 效果的 都列举出来吧，毕竟 经验这东西 还是很重要的 希望大家不吝赐教，我们一相互讨论。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 PCR技术 | 【分子生物】EPI帖 | 土壤微生物 |
» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有194人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 外周血 与PCR扩增问题
已经有5人回复
- 求助PCR扩增试验遇到的问题？
已经有12人回复
- 鼠基因组的PCR扩增
已经有4人回复
- 荧光定量PCR扩增效率低
已经有16人回复
- 如何利用基因组DNA进行real time PCR ？？？？
已经有4人回复
- RT-PCR扩增目的基因片度大小是362bp，PCR的时候使用什么聚合酶好些呢？
已经有5人回复
- 进行点突变的pcr，不能扩增出产物
已经有3人回复
- 求助求助！！！不同大鼠的同一基因的荧光定量实时PCR实验是否需要设计不同的引物
已经有8人回复
- 基因组PCR的问题
已经有3人回复
- 提基因组的时候做第一次PCR效果很好，但是直接以PCR产物做第二次PCR的模版后...
已经有14人回复
- 大片段PCR(2.1K)扩增求助
已经有12人回复
- PCR中引物终浓度是多少
已经有9人回复
- 大片段PCR扩增求助
已经有34人回复
- 环状基因组的PCR
已经有4人回复
- 提基因组的问题
已经有12人回复
- 基因组中长片段PCR应该注意的几个问题
已经有14人回复
- 真菌ITS序列PCR扩增 求助
已经有9人回复
- PCR扩增出现的问题
已经有9人回复
- 看看我的DNA提取及PCR结果有什么问题
已经有11人回复
- 求助！PCR扩增不出全长DNA序列怎么办？
已经有24人回复
- 【求助】土壤机械组成问题
已经有12人回复
- 【求助/交流】基因组PCR老P不出目的带
已经有39人回复
- 【求助/交流】在真菌基因组中PCR基因，难吗？
已经有18人回复
老夏853
铁杆木虫 (著名写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 24 (小学生)
- 金币: 5955.8
- 散金: 1705
- 红花: 17
- 帖子: 2080
- 在线: 1238.7小时
- 虫号: 463482
- 注册: 2007-11-20
- 专业: 食品加工技术
|
首先 很感谢您的无私交流精神和耐心的打字以及负责任的再次编辑！！小木虫应该就像这样的回帖多一点 而不是日发帖量最多的是什么虫友互识什么云云~~ 结合我一直的实验经验，我感觉有以下几点值得注意： 1 腐植酸的问题。虽然不能完全去掉，我们可以想办法减少，在提取DNA 的时候，一般手提的方法都会加入去腐植酸的缓冲液清洗步骤，在此，我个人经验发现，减少土壤的量以及加大缓冲液的体积以及增加一次洗涤，可以减少腐植酸的存留，不过这里应该注意，12000转离心时间不能太久，如果太久，洗过之后上清液颜色比较浅，个人感觉好像腐植酸还能离心下去一样；另外，如果离心时间不够菌体损失会对DNA 量以及多样性造成影响，此处应权衡； 2 引物的问题：引物的加入量，我试过20uM 浓度的加0.25,0.4.0.5ul，结果发现，引物一定量足以反应，电泳照片泳道背景出现抹带，应该是底物没有彻底反应，并不是引物量不足，而关键模板可能存在什么东西抑制引物和模板的结合，而导致扩增效率不高； 3 确实存在聚合酶适应性问题，感觉有的聚合酶就是适应用来扩增模板复杂的样本，之前我们实验室一直用的是takara的 extaq 酶，按理说价格和品质 应该是比较好的了 ，可就是一直扩增不出来，后来我突发奇想换换mix 试试，我试过康为世纪的es taqmix ，效果挺好，虽然条带不是很亮，很粗，但是亮度还是能接受的。在这里我申明我没有诋毁宝生物也没有给康为世纪做广告，我只是就事论事，takara的酶可能品质是好，不过不一定适应复杂模板的扩增，另外，这个康为世纪的mix内可能添加什么保护剂。 最后，保护剂的问题，二甲基亚砜我们实验室有师兄加过，bsa 我们现在还在加。一般文献里面提到的都是1%的BSA，我也是按照1做的 但是效果不好，偶然看到一篇说是BSA 5%，我就试了试，发现确实有效果，后来我做了1，2，3，4，5%的梯度，结果发现，2%以后到5%，亮度逐渐增加，但是不明显，不过用肉眼还是很明显能看出4%和5%浓度的条带亮度明显比前面的要亮。 呵呵 思维有点混乱，废话有点多 见谅 各位！ [ Last edited by 老夏853 on 2011-9-4 at 09:13 ] |
15楼2011-09-03 22:54:38
cexoihtydx
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 5
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 581.3
- 散金: 906
- 红花: 5
- 帖子: 766
- 在线: 263.3小时
- 虫号: 722752
- 注册: 2009-03-14
- 性别: GG
- 专业: 人类遗传学
20楼2011-09-05 19:45:17
老夏853
铁杆木虫 (著名写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 24 (小学生)
- 金币: 5955.8
- 散金: 1705
- 红花: 17
- 帖子: 2080
- 在线: 1238.7小时
- 虫号: 463482
- 注册: 2007-11-20
- 专业: 食品加工技术
2楼2011-08-30 14:20:59
老夏853
铁杆木虫 (著名写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 24 (小学生)
- 金币: 5955.8
- 散金: 1705
- 红花: 17
- 帖子: 2080
- 在线: 1238.7小时
- 虫号: 463482
- 注册: 2007-11-20
- 专业: 食品加工技术
就真的没有人愿意出来交流一下吗 3楼2011-08-30 19:36:40
翰章
新虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 1916.5
- 散金: 240
- 帖子: 72
- 在线: 85.3小时
- 虫号: 1346181
- 注册: 2011-07-15
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
4楼2011-08-30 22:40:48
quiller2000
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 160 (高中生)
- 贵宾: 0.114
- 金币: 2752.9
- 散金: 50
- 红花: 26
- 帖子: 1168
- 在线: 167.3小时
- 虫号: 895537
- 注册: 2009-11-06
- 性别: GG
- 专业: 微生物资源与分类学
5楼2011-08-30 23:19:23
bear0329
金虫 (正式写手)
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 691.1
- 散金: 26
- 帖子: 390
- 在线: 190.7小时
- 虫号: 1218361
- 注册: 2011-03-02
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
6楼2011-08-31 07:08:45
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
|
本帖内容被屏蔽 |
7楼2011-08-31 09:06:49
老夏853
铁杆木虫 (著名写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 24 (小学生)
- 金币: 5955.8
- 散金: 1705
- 红花: 17
- 帖子: 2080
- 在线: 1238.7小时
- 虫号: 463482
- 注册: 2007-11-20
- 专业: 食品加工技术
8楼2011-08-31 12:19:22
老夏853
铁杆木虫 (著名写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 24 (小学生)
- 金币: 5955.8
- 散金: 1705
- 红花: 17
- 帖子: 2080
- 在线: 1238.7小时
- 虫号: 463482
- 注册: 2007-11-20
- 专业: 食品加工技术
9楼2011-08-31 12:20:02
tingspdf
至尊木虫 (著名写手)
- 应助: 6 (幼儿园)
- 金币: 11292.8
- 散金: 137
- 红花: 3
- 帖子: 2033
- 在线: 1241.2小时
- 虫号: 875792
- 注册: 2009-10-18
- 专业: 环境微生物学
10楼2011-09-01 21:54:39
20