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老夏853铁杆木虫 (著名写手)
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[交流]
求助 土壤基因组 PCR 扩增问题已有15人参与
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跟很多人一样 做的是土壤微生物多样性 这里，我觉得有一个很大的瓶颈 就是提取基因组之后的PCR扩增问题。因为后面的所有分子水平的分析都建立在PCR 扩增的基础上。可是 我做了很久，这个扩增效果总是不理想。 在此发帖，希望做类似工作的 能够将自己在实验过程中的心得一一列举出来 不论什么因素 只要是自己觉得影响pCR 效果的 都列举出来吧，毕竟 经验这东西 还是很重要的 希望大家不吝赐教，我们一相互讨论。 |
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 PCR技术 | 【分子生物】EPI帖 | 土壤微生物 |
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老夏853
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首先 很感谢您的无私交流精神和耐心的打字以及负责任的再次编辑！！小木虫应该就像这样的回帖多一点 而不是日发帖量最多的是什么虫友互识什么云云~~ 结合我一直的实验经验，我感觉有以下几点值得注意： 1 腐植酸的问题。虽然不能完全去掉，我们可以想办法减少，在提取DNA 的时候，一般手提的方法都会加入去腐植酸的缓冲液清洗步骤，在此，我个人经验发现，减少土壤的量以及加大缓冲液的体积以及增加一次洗涤，可以减少腐植酸的存留，不过这里应该注意，12000转离心时间不能太久，如果太久，洗过之后上清液颜色比较浅，个人感觉好像腐植酸还能离心下去一样；另外，如果离心时间不够菌体损失会对DNA 量以及多样性造成影响，此处应权衡； 2 引物的问题：引物的加入量，我试过20uM 浓度的加0.25,0.4.0.5ul，结果发现，引物一定量足以反应，电泳照片泳道背景出现抹带，应该是底物没有彻底反应，并不是引物量不足，而关键模板可能存在什么东西抑制引物和模板的结合，而导致扩增效率不高； 3 确实存在聚合酶适应性问题，感觉有的聚合酶就是适应用来扩增模板复杂的样本，之前我们实验室一直用的是takara的 extaq 酶，按理说价格和品质 应该是比较好的了 ，可就是一直扩增不出来，后来我突发奇想换换mix 试试，我试过康为世纪的es taqmix ，效果挺好，虽然条带不是很亮，很粗，但是亮度还是能接受的。在这里我申明我没有诋毁宝生物也没有给康为世纪做广告，我只是就事论事，takara的酶可能品质是好，不过不一定适应复杂模板的扩增，另外，这个康为世纪的mix内可能添加什么保护剂。 最后，保护剂的问题，二甲基亚砜我们实验室有师兄加过，bsa 我们现在还在加。一般文献里面提到的都是1%的BSA，我也是按照1做的 但是效果不好，偶然看到一篇说是BSA 5%，我就试了试，发现确实有效果，后来我做了1，2，3，4，5%的梯度，结果发现，2%以后到5%，亮度逐渐增加，但是不明显，不过用肉眼还是很明显能看出4%和5%浓度的条带亮度明显比前面的要亮。 呵呵 思维有点混乱，废话有点多 见谅 各位！ [ Last edited by 老夏853 on 2011-9-4 at 09:13 ] |
15楼2011-09-03 22:54:38
cexoihtydx
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20楼2011-09-05 19:45:17
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就真的没有人愿意出来交流一下吗3楼2011-08-30 19:36:40
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6楼2011-08-31 07:08:45
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7楼2011-08-31 09:06:49
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9楼2011-08-31 12:20:02
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