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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助 土壤基因组 PCR 扩增问题
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 求助 土壤基因组 PCR 扩增问题 已有15人参与

跟很多人一样 做的是土壤微生物多样性
这里，我觉得有一个很大的瓶颈 就是提取基因组之后的PCR扩增问题。因为后面的所有分子水平的分析都建立在PCR 扩增的基础上。可是 我做了很久，这个扩增效果总是不理想。
在此发帖，希望做类似工作的 能够将自己在实验过程中的心得一一列举出来 不论什么因素 只要是自己觉得影响pCR 效果的 都列举出来吧，毕竟 经验这东西 还是很重要的 希望大家不吝赐教，我们一相互讨论。
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PCR技术 【分子生物】EPI帖 土壤微生物

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1楼 2011-08-29 20:35:13
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by cexoihtydx at 2011-09-03 13:51:39:
1 土壤宏基因组提取，腐质酸对后续PCR影响较大，没有比较好的解决办法。
2 我们组有中国70多个不同地理环境采集的土壤，土壤DNA做PCR时模板投入量常为20 ng每50 ul反应体系。
3 引物的种类不同，差异也很大。我 ...

首先 很感谢您的无私交流精神和耐心的打字以及负责任的再次编辑！！小木虫应该就像这样的回帖多一点 而不是日发帖量最多的是什么虫友互识什么云云~~

结合我一直的实验经验，我感觉有以下几点值得注意：
1 腐植酸的问题。虽然不能完全去掉，我们可以想办法减少，在提取DNA 的时候，一般手提的方法都会加入去腐植酸的缓冲液清洗步骤，在此，我个人经验发现，减少土壤的量以及加大缓冲液的体积以及增加一次洗涤，可以减少腐植酸的存留，不过这里应该注意，12000转离心时间不能太久，如果太久，洗过之后上清液颜色比较浅，个人感觉好像腐植酸还能离心下去一样；另外，如果离心时间不够菌体损失会对DNA 量以及多样性造成影响，此处应权衡；
2 引物的问题：引物的加入量，我试过20uM 浓度的加0.25,0.4.0.5ul，结果发现，引物一定量足以反应，电泳照片泳道背景出现抹带，应该是底物没有彻底反应，并不是引物量不足，而关键模板可能存在什么东西抑制引物和模板的结合，而导致扩增效率不高；
3 确实存在聚合酶适应性问题，感觉有的聚合酶就是适应用来扩增模板复杂的样本，之前我们实验室一直用的是takara的  extaq 酶，按理说价格和品质 应该是比较好的了 ，可就是一直扩增不出来，后来我突发奇想换换mix 试试，我试过康为世纪的es taqmix ，效果挺好，虽然条带不是很亮，很粗，但是亮度还是能接受的。在这里我申明我没有诋毁宝生物也没有给康为世纪做广告，我只是就事论事，takara的酶可能品质是好，不过不一定适应复杂模板的扩增，另外，这个康为世纪的mix内可能添加什么保护剂。
最后，保护剂的问题，二甲基亚砜我们实验室有师兄加过，bsa 我们现在还在加。一般文献里面提到的都是1%的BSA，我也是按照1做的 但是效果不好，偶然看到一篇说是BSA 5%，我就试了试，发现确实有效果，后来我做了1，2，3，4，5%的梯度，结果发现，2%以后到5%，亮度逐渐增加，但是不明显，不过用肉眼还是很明显能看出4%和5%浓度的条带亮度明显比前面的要亮。


呵呵 思维有点混乱，废话有点多 见谅 各位！

[ Last edited by 老夏853 on 2011-9-4 at 09:13 ]
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15楼2011-09-03 22:54:38
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cexoihtydx

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
15楼: Originally posted by 老夏853 at 2011-09-03 22:54:38:
首先 很感谢您的无私交流精神和耐心的打字以及负责任的再次编辑！！小木虫应该就像这样的回帖多一点 而不是日发帖量最多的是什么虫友互识什么云云~~

结合我一直的实验经验，我感觉有以下几点值得注意：
...

恩，共同学习，共同进步!
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不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
20楼2011-09-05 19:45:17
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普通回帖

老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
希望做这块的虫子们 都能出来交流交流
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2楼2011-08-30 14:20:59
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
就真的没有人愿意出来交流一下吗
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3楼2011-08-30 19:36:40
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翰章

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-08-31 07:40:41
主要是无菌操作；Tm值的确定及时间的确定，以及延伸时间的确定；可以做模板浓度梯度和Tm温度梯度，希望你实验顺利。
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4楼2011-08-30 22:40:48
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quiller2000

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+3): good 2011-08-31 07:40:49
可能最主要的是你的基因组分离要干净

很多所谓的基因组纯化试剂盒由于原理的原因，回收效率比较低，如果你仅仅是用于做PCR扩增，尤其是多样性的实验，你粗提的DNA可以用玻璃珠或者超声波打断一下，然后再过纯化的柱子，这样回收率会高一些，从而使得你后续的PCR会容易一些！

可能说的不对，这个没有搞过，呵呵！
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致良知
5楼2011-08-30 23:19:23
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bear0329

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): 鼓励经验交流 2011-08-31 07:41:05
提得高质量的DNA是关键，个人觉得手提的比较好一点，
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以马内利！
6楼2011-08-31 07:08:45
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fcheng025

禁虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
7楼2011-08-31 09:06:49
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by quiller2000 at 2011-08-30 23:19:23:
可能最主要的是你的基因组分离要干净

很多所谓的基因组纯化试剂盒由于原理的原因，回收效率比较低，如果你仅仅是用于做PCR扩增，尤其是多样性的实验，你粗提的DNA可以用玻璃珠或者超声波打断一下，然后再过纯化 ...

还是杂质干扰的问题，我们也觉得是这个引起的因为 图让个中粗提的dna 就就是很脏，颜色很明显褐红色，如果要纯化的话  不论是胶回收还是别的什么办法 损失是肯定有的。目前做多样性我觉得这是一个很大的瓶颈，就是为了要DNA 量大 才不想用试剂盒，后面却步好做  谢谢你的提醒
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8楼2011-08-31 12:19:22
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by fcheng025 at 2011-08-31 09:06:49:
腐植酸影响太大咧

有什么好办法能 去腐植酸么 比如在提前DNA是时候 用什么溶液清洗 效果比较好呢  你们有做这个么？
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9楼2011-08-31 12:20:02
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-09-04 18:56:31
我们都是试剂盒提取，好一点的像MP-bio的Fast DNA spin kit for soil，要是资金不允许，用OMEGA的soil DNA Kit也可以，1500可以做50次，不是特别贵
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10楼2011-09-01 21:54:39
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