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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助 土壤基因组 PCR 扩增问题
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by tingspdf at 2011-09-01 21:54:39:
我们都是试剂盒提取，好一点的像MP-bio的Fast DNA spin kit for soil，要是资金不允许，用OMEGA的soil DNA Kit也可以，1500可以做50次，不是特别贵

上回跟一个老师交流说 他们用试剂盒 估计只能提到土壤中总DNA 的10% 左右吧  我个人觉得做多样性 DNA提取方法上还是要以能提到尽量多的DNA 为佳，不过则样子 提到的DNA 又很脏 会影响后面的后续实验 着实是个瓶颈
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11楼2011-09-02 09:36:18
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lee.walker

木虫 (正式写手)
★ ★
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西瓜(金币+1): Good 2011-09-02 11:05:21
用试剂盒提取，多做几个平行重复！分别做PCR、纯化回收，然后混合后进行多样性分析！
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12楼2011-09-02 10:33:26
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by lee.walker at 2011-09-02 10:33:26:
用试剂盒提取，多做几个平行重复！分别做PCR、纯化回收，然后混合后进行多样性分析！

这样也行 不过这样子  由于平行混合引起的差异性 应该与样品本身之间的差异性引起的多样性可以相提并论了
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13楼2011-09-02 11:42:30
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cexoihtydx

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+5, MolEPI+1): 欢迎多来交流，鼓励啊 2011-09-03 15:33:30
1 土壤宏基因组提取，腐质酸对后续PCR影响较大，没有比较好的解决办法。
2 我们组有中国70多个不同地理环境采集的土壤，土壤DNA做PCR时模板投入量常为20 ng每50 ul反应体系。
3 引物的种类不同，差异也很大。我们的经验是: 根据基因氨基酸保守区设计的特异性引物较好;其次是通过基因氨基酸序列比对后在保守区设计的低兼并度的兼并引物;效果最不好的就是非氨基酸保守区的特异性引物和氨基酸保守区的高兼并度的兼并引物!当然因土壤基因多样性差异很大，以上经验不一定普遍适用。
4 引物浓度也需要摸索，特别是在使用兼并引物时，兼并度越大，引物的加入量也要相应提高。
5 土壤基因组中含有目的基因的量有时很低很低，不同DNA聚合酶对模板的认别能力也存在差异，往往扩增效率低，目的条带很淡，个人经验是rtaq对低浓度模板的识别能力最强;但试验目的不同，为避免基因因扩增而产生碱基突变，常需要使用高保真聚合酶。
6 PCR时加入一些PCR添加剂，可起到积极的效果，如BSA， DMSO， TWeen20, NP40, DTT等。个人经验: PCR时加入2.5%的BSA效果较好，能提高PCR的扩增效率!

[ Last edited by cexoihtydx on 2011-9-3 at 21:10 ]
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不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
14楼2011-09-03 13:51:39
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by cexoihtydx at 2011-09-03 13:51:39:
1 土壤宏基因组提取，腐质酸对后续PCR影响较大，没有比较好的解决办法。
2 我们组有中国70多个不同地理环境采集的土壤，土壤DNA做PCR时模板投入量常为20 ng每50 ul反应体系。
3 引物的种类不同，差异也很大。我 ...

首先 很感谢您的无私交流精神和耐心的打字以及负责任的再次编辑！！小木虫应该就像这样的回帖多一点 而不是日发帖量最多的是什么虫友互识什么云云~~

结合我一直的实验经验，我感觉有以下几点值得注意：
1 腐植酸的问题。虽然不能完全去掉，我们可以想办法减少，在提取DNA 的时候，一般手提的方法都会加入去腐植酸的缓冲液清洗步骤，在此，我个人经验发现，减少土壤的量以及加大缓冲液的体积以及增加一次洗涤，可以减少腐植酸的存留，不过这里应该注意，12000转离心时间不能太久，如果太久，洗过之后上清液颜色比较浅，个人感觉好像腐植酸还能离心下去一样；另外，如果离心时间不够菌体损失会对DNA 量以及多样性造成影响，此处应权衡；
2 引物的问题：引物的加入量，我试过20uM 浓度的加0.25,0.4.0.5ul，结果发现，引物一定量足以反应，电泳照片泳道背景出现抹带，应该是底物没有彻底反应，并不是引物量不足，而关键模板可能存在什么东西抑制引物和模板的结合，而导致扩增效率不高；
3 确实存在聚合酶适应性问题，感觉有的聚合酶就是适应用来扩增模板复杂的样本，之前我们实验室一直用的是takara的  extaq 酶，按理说价格和品质 应该是比较好的了 ，可就是一直扩增不出来，后来我突发奇想换换mix 试试，我试过康为世纪的es taqmix ，效果挺好，虽然条带不是很亮，很粗，但是亮度还是能接受的。在这里我申明我没有诋毁宝生物也没有给康为世纪做广告，我只是就事论事，takara的酶可能品质是好，不过不一定适应复杂模板的扩增，另外，这个康为世纪的mix内可能添加什么保护剂。
最后，保护剂的问题，二甲基亚砜我们实验室有师兄加过，bsa 我们现在还在加。一般文献里面提到的都是1%的BSA，我也是按照1做的 但是效果不好，偶然看到一篇说是BSA 5%，我就试了试，发现确实有效果，后来我做了1，2，3，4，5%的梯度，结果发现，2%以后到5%，亮度逐渐增加，但是不明显，不过用肉眼还是很明显能看出4%和5%浓度的条带亮度明显比前面的要亮。


呵呵 思维有点混乱，废话有点多 见谅 各位！

[ Last edited by 老夏853 on 2011-9-4 at 09:13 ]
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15楼2011-09-03 22:54:38
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)
★
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11楼: Originally posted by 老夏853 at 2011-09-02 09:36:18:
上回跟一个老师交流说 他们用试剂盒 估计只能提到土壤中总DNA 的10% 左右吧  我个人觉得做多样性 DNA提取方法上还是要以能提到尽量多的DNA 为佳，不过则样子 提到的DNA 又很脏 会影响后面的后续实验 着实是个瓶颈

那就做做加标回收率的实验，看看能提出来多少
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16楼2011-09-04 15:22:00
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qiyi_love@

新虫 (初入文坛)
★
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尽可能的将土壤中所有的微生物DNA提出来对于做多样性来说很重要，比如说有的微生物壁特别难破，要是没有破壁充分的话，其DNA很难释放出来，所以破壁的方法很重要吧
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17楼2011-09-04 16:53:49
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by tingspdf at 2011-09-04 15:22:00:
那就做做加标回收率的实验，看看能提出来多少

这个方法的验证 我不做 跟我的方向主线有点远了
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18楼2011-09-04 18:21:00
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by qiyi_love@ at 2011-09-04 16:53:49:
尽可能的将土壤中所有的微生物DNA提出来对于做多样性来说很重要，比如说有的微生物壁特别难破，要是没有破壁充分的话，其DNA很难释放出来，所以破壁的方法很重要吧

很有道理。目前我们用但是是溶菌酶。但是我怀疑溶菌酶在这种复杂条件下的效率何如？ 听说sigma 有一种细胞壁崩溃酶 我去 这个名字~~  我用同学用来做霉菌感受态，据说去壁 效果不错 想用来试试
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19楼2011-09-04 18:22:48
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cexoihtydx

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
15楼: Originally posted by 老夏853 at 2011-09-03 22:54:38:
首先 很感谢您的无私交流精神和耐心的打字以及负责任的再次编辑！！小木虫应该就像这样的回帖多一点 而不是日发帖量最多的是什么虫友互识什么云云~~

结合我一直的实验经验，我感觉有以下几点值得注意：
...

恩，共同学习，共同进步!
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不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
20楼2011-09-05 19:45:17
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