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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

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专业: 食品加工技术

[交流] 求助土壤基因组 PCR 扩增问题已有15人参与

跟很多人一样做的是土壤微生物多样性
这里，我觉得有一个很大的瓶颈就是提取基因组之后的PCR扩增问题。因为后面的所有分子水平的分析都建立在PCR 扩增的基础上。可是我做了很久，这个扩增效果总是不理想。
在此发帖，希望做类似工作的能够将自己在实验过程中的心得一一列举出来不论什么因素只要是自己觉得影响pCR 效果的都列举出来吧，毕竟经验这东西还是很重要的希望大家不吝赐教，我们一相互讨论。

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1楼 2011-08-29 20:35:13

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cexoihtydx

金虫 (正式写手)

MolEPI: 5
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专业: 人类遗传学

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 欢迎多来交流，鼓励啊 2011-09-03 15:33:30

1 土壤宏基因组提取，腐质酸对后续PCR影响较大，没有比较好的解决办法。
2 我们组有中国70多个不同地理环境采集的土壤，土壤DNA做PCR时模板投入量常为20 ng每50 ul反应体系。
3 引物的种类不同，差异也很大。我们的经验是: 根据基因氨基酸保守区设计的特异性引物较好;其次是通过基因氨基酸序列比对后在保守区设计的低兼并度的兼并引物;效果最不好的就是非氨基酸保守区的特异性引物和氨基酸保守区的高兼并度的兼并引物!当然因土壤基因多样性差异很大，以上经验不一定普遍适用。
4 引物浓度也需要摸索，特别是在使用兼并引物时，兼并度越大，引物的加入量也要相应提高。
5 土壤基因组中含有目的基因的量有时很低很低，不同DNA聚合酶对模板的认别能力也存在差异，往往扩增效率低，目的条带很淡，个人经验是rtaq对低浓度模板的识别能力最强;但试验目的不同，为避免基因因扩增而产生碱基突变，常需要使用高保真聚合酶。
6 PCR时加入一些PCR添加剂，可起到积极的效果，如BSA， DMSO， TWeen20, NP40, DTT等。个人经验: PCR时加入2.5%的BSA效果较好，能提高PCR的扩增效率!

[ Last edited by cexoihtydx on 2011-9-3 at 21:10 ]