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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段PCR扩增求助
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lyta0

木虫 (小有名气)

[求助] 大片段PCR扩增求助

我要扩增一个片段为3623bp的DNA,条件如下：98℃1分钟，然后是四十个循环：98℃10秒，52℃10秒，68℃3分30秒，最后是68℃6分钟，扩了好几次都失败，求助各位高手
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【分子生物】EPI帖 实验求助

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1楼 2012-01-18 18:27:09
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回帖置顶 ( 共有3个 )

鱼山听涛

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 分析得很有道理！ 2012-01-20 14:10:38
lyta0(金币+5): 2012-01-20 16:07:36
1、如果已知所扩序列，看一下GC含量。如果GC含量高就改用GC buffer。
2、普通Taq扩增3-4 kb条带没有问题，如果不放心，可以用Takara的LA Taq。
3、解链和退火时间延长到30 sec。
4、Taq系列的扩增速度是2 kb/min，所以你用3.5 min延伸没有问题，循环数改为30即可，过多没有用处。
5、退火温度应该根据引物确定，一般为引物Tm减去5到10度。你没有批出来，可以考虑降低退火温度。
6、引物量是否够？有引物带吗？如果没有，增加引物用量。
7、模板量是否够？
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书到用时方恨少
14楼2012-01-20 09:31:56
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chenglong_li

铁杆木虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-04-03 15:00:15
引用回帖:
21楼: Originally posted by chenglong_li at 2012-04-02 10:20:51:
问题一样啊，3kb多的片段，扩了一个月，也没有好的电泳结果。
我分析或许与所扩增的基因有关系，其高级结果比较复杂，变性时间短的话解链不充分，变性时间长的话造成模板损伤，退火温度高的话引物与模板结合不充 ...

昨天上午看了大家发的帖，晚上我就p出来了！
Thank all of you very much!
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西瓜
22楼2012-04-03 08:11:53
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chenglong_li

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小丹木木: 回帖置顶 2012-04-05 13:43:12
小丹木木: 金币+2, 很有帮助 2012-04-05 13:44:55
模板：我用“细菌基因组DNA提取试剂盒”进行了纯化;
Taq酶：换用了TaKaRa的Premix Taq Version 2.0(Loading dye mix);
反应：变性时间从1min减为30sec;
希望对大家有所帮助！
再次感谢大家！Thank you!
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24楼2012-04-05 12:49:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
lyta0(金币+5): ★★★很有帮助 2012-01-18 21:13:19
3.6kb并不大，应该不难。
我觉得变性和退火的时间短了点，我们实验室一般用95℃/30秒变性，55℃/45秒退火，我自己用的是95℃/20秒变性，55℃/30秒退火。上面说的是常用的条件，如果扩增不出来就降低退火温度，特异性不高就提高退火温度，一般都能做出来的。
Taq酶每分钟扩增1kb，延伸时间3分30秒感觉不够。虽然一般这样也能做出来，但是既然你没做出来，我建议延伸时间改成4分钟。
另外，试剂也可能出问题。你的试剂做其他PCR是否正常呢？
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2楼2012-01-18 18:59:32
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bearjazz

木虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2012-01-19 18:13:20
这两天，我p了一个2700bp的片段，延伸时间7分钟，退火时间1分钟，效果不错，送华大测通，拼接结果

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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沉闷科学的掘墓人
7楼2012-01-19 06:56:47
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普通回帖

lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-18 18:59:32:
3.6kb并不大，应该不难。
我觉得变性和退火的时间短了点，我们实验室一般用95℃/30秒变性，55℃/45秒退火，我自己用的是95℃/20秒变性，55℃/30秒退火。上面说的是常用的条件，如果扩增不出来就降低退火温度，特 ...

我现在正在用别人的dNTP和buffer重新PCR,希望能P出来，结果再告诉你，但是我以前也是这个试剂，P1000多bp的就能P出来
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3楼2012-01-18 21:05:55
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lyta0 at 2012-01-18 21:05:55:
我现在正在用别人的dNTP和buffer重新PCR,希望能P出来，结果再告诉你，但是我以前也是这个试剂，P1000多bp的就能P出来

呵呵，我们是鼓励反馈的哦~
祝实验顺利哈
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4楼2012-01-19 00:04:46
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lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-19 00:04:46:
呵呵，我们是鼓励反馈的哦~
祝实验顺利哈

bad news, 还是没有问题，证明不是试剂的问题，看来得改条件了
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5楼2012-01-19 01:07:21
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cnliu51

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励交流~春节快乐哦~ 2012-01-20 14:09:55
稍长一点的片段，建议用TAKARA的LaTaq。我们用这种酶批出过2万bp的片段（两步法），对于3千多的片段，3步法没问题（我前不久用3步法批出过6千多的片段）。关于PCR程序，再大的片段，变性用94度20秒也足够了，除非片段中含有高比例GC，对于这种情况，我们一般用TAKARA的高GC含量BUFFER.
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6楼2012-01-19 06:44:09
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缘何

新虫 (初入文坛)
★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2012-01-19 18:13:37
可以试着加入甘油和DMSO，可代替GC buffer，对长片段扩增尤其是GC含量高的效果很好。 另外ＰＣＲ条件用梯度温度试一下。
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8楼2012-01-19 10:49:17
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): Good！ 2012-01-19 18:13:55
感觉你这有点问题，我们这PCR P3000  4000 什么的各种没压力啊，还是你的酶不给力啊，我们扩质粒环改点扩4000的太正常了，载体就3000了 随意一个片段也超过1000啊 建议换酶 实际上TAKARA 的LA TAQ 也一般 只是比他们普通的酶保证性高一些，建议用PFU，不知道你是什么模板
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9楼2012-01-19 12:10:49
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lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 393658000 at 2012-01-19 12:10:49:
感觉你这有点问题，我们这PCR P3000  4000 什么的各种没压力啊，还是你的酶不给力啊，我们扩质粒环改点扩4000的太正常了，载体就3000了 随意一个片段也超过1000啊 建议换酶 实际上TAKARA 的LA TAQ 也一般 只是比他 ...

用的模板是cDNA,酶是Phusion High-Fidelity DNA Polymerase
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10楼2012-01-19 16:29:55
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