应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段PCR扩增求助
51/1返回列表
查看: 6020  |  回复: 34
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

lyta0

木虫 (小有名气)

[求助] 大片段PCR扩增求助

我要扩增一个片段为3623bp的DNA,条件如下：98℃1分钟，然后是四十个循环：98℃10秒，52℃10秒，68℃3分30秒，最后是68℃6分钟，扩了好几次都失败，求助各位高手
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖 实验求助

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-01-18 18:27:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lyta0 at 2012-01-18 21:05:55:
我现在正在用别人的dNTP和buffer重新PCR,希望能P出来，结果再告诉你，但是我以前也是这个试剂，P1000多bp的就能P出来

呵呵，我们是鼓励反馈的哦~
祝实验顺利哈
赞一下 回复此楼
4楼2012-01-19 00:04:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 35 个回答

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
lyta0(金币+5): ★★★很有帮助 2012-01-18 21:13:19
3.6kb并不大，应该不难。
我觉得变性和退火的时间短了点，我们实验室一般用95℃/30秒变性，55℃/45秒退火，我自己用的是95℃/20秒变性，55℃/30秒退火。上面说的是常用的条件，如果扩增不出来就降低退火温度，特异性不高就提高退火温度，一般都能做出来的。
Taq酶每分钟扩增1kb，延伸时间3分30秒感觉不够。虽然一般这样也能做出来，但是既然你没做出来，我建议延伸时间改成4分钟。
另外，试剂也可能出问题。你的试剂做其他PCR是否正常呢？
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2012-01-18 18:59:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-18 18:59:32:
3.6kb并不大，应该不难。
我觉得变性和退火的时间短了点，我们实验室一般用95℃/30秒变性，55℃/45秒退火，我自己用的是95℃/20秒变性，55℃/30秒退火。上面说的是常用的条件，如果扩增不出来就降低退火温度，特 ...

我现在正在用别人的dNTP和buffer重新PCR,希望能P出来，结果再告诉你，但是我以前也是这个试剂，P1000多bp的就能P出来
赞一下 回复此楼
3楼2012-01-18 21:05:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-19 00:04:46:
呵呵，我们是鼓励反馈的哦~
祝实验顺利哈

bad news, 还是没有问题，证明不是试剂的问题，看来得改条件了
赞一下 回复此楼
5楼2012-01-19 01:07:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 35 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 3/150 2026-08-22 22:03 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-22 21:54 by OEbVnUOu01ol
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 7/350 2026-08-22 21:39 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 4/200 2026-08-22 16:52 by sunzitan
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +10 kulium 2026-08-21 13/650 2026-08-21 21:58 by alongwaytogo
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +11 大萍1987 2026-08-20 13/650 2026-08-21 14:48 by 20120902066
[基金申请] 我面上完蛋了 +7 且听虎啸 2026-08-20 8/400 2026-08-21 12:31 by 酷酷墨镜
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭