应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】荧光PCR扩增曲线问题
191/1返回列表
查看: 4707  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

love_st

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】荧光PCR扩增曲线问题

我的一对引物探针，高浓度的扩增没有问题，而低浓度却扩增不好，荧光信号很低，为什么？图中那两条扩增曲线是模板浓度十倍稀释的！请大家帮我看看哦！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2010-12-08 16:59:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

silicare

荣誉版主 (文坛精英)
love_st(金币+7):谢谢，我想改变下引物或许有好的结果 2010-12-09 15:39:13
引用回帖:
Originally posted by love_st at 2010-12-09 11:44:35:

ABI7500的，染料是FAM，荧光值和模板浓度一般也是会呈现梯度下降的，这个下降的太多了，所以图形很难看，我想知道或者想讨论的是，什么因素导致低浓度的扩增效率不高，我想可能是我的引物本身的问题，那么能否改 ...

低浓度模板扩增效率问题是一个普遍的现象，和引物质量有直接关系

1，不管有没有扩增出目的片段，只要里边有模板，从第一个循环开始就会消耗引物，而且模板越多越复杂，消耗就越大，基因组远大于质粒的消耗。这样30个循环下来就消耗了大量的引物，越往后效率越低是难免的

2，引物的初始浓度也不能太高了，太高了就会增加非特异性和二聚体等杂带

3，如果引物本身的质量不是特别好，经过30轮的折腾，里边难免会形成一些引物自身的二级结构导致引物序列的改变（taq酶是很厉害的，只要有一点点的机会，他也能给你往上添加碱基。这个你应该可以理解）

所以，以上三点不难看出，为什么大家都知道低浓度模板扩增效果差，却无法解决了

貌似你的问题如果想彻底解决，推荐换一对更好的引物。

不过半对数的图也行会更好

个人观点
赞一下(2人) 回复此楼
9楼2010-12-09 15:10:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

love_st

金虫 (著名写手)
自己顶顶
回复此楼
2楼2010-12-09 08:41:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

silicare

荣誉版主 (文坛精英)
love_st(金币+1):谢谢交流 2010-12-09 08:59:09
做了几个复孔啊， 第二条明显不对啊
赞一下 回复此楼
3楼2010-12-09 08:50:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-12-09 08:50:27:
做了几个复孔啊， 第二条明显不对啊

做了很多重复，这对引物探针就是这样，高浓度的模板扩增挺好，就是低浓度的模板突然不呈梯度的荧光信号突然下降的厉害，体系优化似乎也优化不出来
赞一下 回复此楼
4楼2010-12-09 08:58:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

silicare

荣誉版主 (文坛精英)
最好还是多些数据，两条线不太好分析啊

[ Last edited by silicare on 2010-12-9 at 09:50 ]
赞一下 回复此楼
5楼2010-12-09 10:32:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-12-09 10:32:21:
最好还是多些数据，两条线不太好分析啊

[ Last edited by silicare on 2010-12-9 at 09:50 ]

你看下图
赞一下 回复此楼
6楼2010-12-09 12:25:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

silicare

荣誉版主 (文坛精英)
love_st(金币+2): 2010-12-09 12:44:45
什么机子什么染料（探针标记染料）啊，荧光值现实好高啊

浓度低了的时候，ct值超过30的时候都容易出现这种情况

不知你这事rn还是delta rn

貌似ct值还比较正常，你换成半对数图看看吧，那样应该更直观好看一些
赞一下 回复此楼
7楼2010-12-09 12:32:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-12-09 12:32:54:
什么机子什么染料（探针标记染料）啊，荧光值现实好高啊

浓度低了的时候，ct值超过30的时候都容易出现这种情况

不知你这事rn还是delta rn

貌似ct值还比较正常，你换成半对数图看看吧，那样应该更直观好看 ...

ABI7500的，染料是FAM，荧光值和模板浓度一般也是会呈现梯度下降的，这个下降的太多了，所以图形很难看，我想知道或者想讨论的是，什么因素导致低浓度的扩增效率不高，我想可能是我的引物本身的问题，那么能否改变什么条件能改善呢？
赞一下 回复此楼
8楼2010-12-09 12:44:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wps1234

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
很可能是试剂与一起不匹配，重新优化下反应液吧
赞一下 回复此楼
10楼2012-06-07 18:58:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wps1234

新虫 (初入文坛)
试剂与仪器不匹配，优化下反应液吧
赞一下 回复此楼
11楼2012-06-07 18:59:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大甫哥

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也遇到同样的问题，我们实验室的师姐建议我换一种酶试试，可我哪知道换什么酶效果好啊？
赞一下 回复此楼
12楼2014-06-12 08:32:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 大甫哥 at 2014-06-12 08:32:37
我也遇到同样的问题，我们实验室的师姐建议我换一种酶试试，可我哪知道换什么酶效果好啊？

好点的热启动酶，不过这个问题我已经解决，换了个引物
赞一下 回复此楼
13楼2014-06-12 08:50:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大甫哥

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by love_st at 2014-06-12 08:50:39
好点的热启动酶，不过这个问题我已经解决，换了个引物...

我的是标准品质粒，浓度高时无引物二聚体，但当降到10^4拷贝就出现引物二聚体了，查询网上说的有加二甲亚砜的，有说优化体系的，还有的说引物二聚体基本难以避免换引物。
      优化体系你是用正交设计吗？还是固定其他条件，只变其中一个？
赞一下 回复此楼
14楼2014-06-12 09:50:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大甫哥

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我用的是taqman探针法，
赞一下 回复此楼
15楼2014-06-12 09:55:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 大甫哥 at 2014-06-12 09:55:59
我用的是taqman探针法，

探针法你怎么知道有引物二聚体？
赞一下 回复此楼
16楼2014-06-12 10:09:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大甫哥

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by love_st at 2014-06-12 10:09:03
探针法你怎么知道有引物二聚体？...

扩增结果跑了个胶，发现低浓度的样品孔均有大小相同的条带，
赞一下 回复此楼
17楼2014-06-12 10:12:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 大甫哥 at 2014-06-12 10:12:39
扩增结果跑了个胶，发现低浓度的样品孔均有大小相同的条带，...

只要荧光PCR影响不大就OK，如果你也像我上面的情况，建议你更换引物
赞一下 回复此楼
18楼2014-06-12 10:21:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

枫素

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by 大甫哥 at 2014-06-12 09:50:34
我的是标准品质粒，浓度高时无引物二聚体，但当降到10^4拷贝就出现引物二聚体了，查询网上说的有加二甲亚砜的，有说优化体系的，还有的说引物二聚体基本难以避免换引物。
      优化体系你是用正交设计吗？还是固 ...

我做的也是质粒标准品，标准曲线一直做不好，求教
赞一下 回复此楼
19楼2015-07-10 17:47:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 love_st 的主题更新
191/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 271材料工程求调剂 +6 .6lL 2026-03-18 6/300 2026-03-19 15:41 by haoshis
[考研] 材料专硕274一志愿陕西师范大学求调剂 +8 薛云鹏 2026-03-13 8/400 2026-03-19 15:36 by haoshis
[考研] 一志愿北京化工大学0703化学318分，有科研经历，求调剂 +3 一瓶苯甲酸 2026-03-14 3/150 2026-03-19 15:17 by 尽舜尧1
[考研] 286求调剂 +6 lemonzzn 2026-03-16 10/500 2026-03-19 14:31 by lemonzzn
[考研] 求调剂 +3 Mqqqqqq 2026-03-19 3/150 2026-03-19 14:11 by peike
[考研] 求调剂，一志愿:南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕，总分289分 +3 @taotao 2026-03-19 3/150 2026-03-19 14:07 by peike
[考研] 294求调剂材料与化工专硕 +11 陌の森林 2026-03-18 11/550 2026-03-19 13:22 by houyaoxu
[考研] 一志愿吉林大学材料学硕321求调剂 +6 Ymlll 2026-03-18 9/450 2026-03-19 10:28 by 星空星月
[考研] 267一志愿南京工业大学0817化工求调剂 +10 SUICHILD 2026-03-12 10/500 2026-03-19 09:51 by Delta2012
[考研] 354求调剂 +4 Tyoumou 2026-03-18 7/350 2026-03-18 21:45 by Tyoumou
[考研] 304求调剂 +12 小熊joy 2026-03-14 13/650 2026-03-18 12:34 by Linda Hu
[考研] 301求调剂 +9 yy要上岸呀 2026-03-17 9/450 2026-03-18 08:58 by 无际的草原
[考博] 26博士申请 +3 1042136743 2026-03-17 3/150 2026-03-17 23:30 by 轻松不少随
[考研] 26考研求调剂 +6 丶宏Sir 2026-03-13 6/300 2026-03-17 16:13 by 醉在风里
[考研] 一志愿211 0703方向310分求调剂 +3 努力奋斗112 2026-03-15 3/150 2026-03-16 16:44 by houyaoxu
[考研] 321求调剂 +5 大米饭！ 2026-03-15 5/250 2026-03-16 16:33 by houyaoxu
[考研] 288求调剂 +4 奇点0314 2026-03-14 4/200 2026-03-14 23:04 by JourneyLucky
[考研] 中科大材料与化工319求调剂 +3 孟鑫材料 2026-03-14 3/150 2026-03-14 20:10 by ms629
[考研] 304求调剂 +7 7712b 2026-03-13 7/350 2026-03-13 21:42 by peike
[考研] 329求调剂 +3 miaodesi 2026-03-12 4/200 2026-03-13 20:53 by 18595523086
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭