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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR扩增效率低
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wangzhe163

金虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR扩增效率低

哪位高人在做相对荧光定量PCR？我最近在做标准曲线的时候遇到麻烦了，还请高人指点迷津啊。
    在绘制标准曲线的时候，标准品是重组质粒，按10倍倍比稀释，取六个稀释度做标准线，R方能在0.99以上，但是扩增效率一直徘徊在55%-75%之间。，看网上说的解决办法：增加引物浓度，降低退火温度，改用三步法，（质粒线性化，我连的T-simple，这个载体上面应该有一个ECORV的酶切位点，但是我就是切不开）。这些方法我都试过了，引物也重新设计了sweat:，用的试剂是宝生物的SYBR，仪器是ABI 7500.
    小弟已困惑多日，请高人指点，在此谢过！
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拼搏定能成功
1楼 2013-01-21 10:14:34
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czfscf

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得 可能是人品的问题 或者天气不好吧 哈哈  路过ing
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Ecological Genomics；the scientific walking hormone
2楼2013-01-21 10:44:50
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是试剂出问题了，换换PCR mix试试
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3楼2013-01-21 10:55:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
T-simple的EcoRV不是T接头的位置吗？如果克隆片段进去后就没有这个酶切位点了。
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4楼2013-01-21 11:19:09
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wangzhe163

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by czfscf at 2013-01-21 10:44:50
我觉得 可能是人品的问题 或者天气不好吧 哈哈  路过ing

我觉得也是人品，前几个效率都好，就这个不行
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拼搏定能成功
5楼2013-01-22 09:20:39
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wangzhe163

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yesali at 2013-01-21 10:55:52
是不是试剂出问题了，换换PCR mix试试

感觉这个可能性比较小，因为这几次用的是一样的试剂，不知道是不是基因本身的问题，这个基因序列是从文献上查的，别人做过的，又是内参，应该不会有啥问题的
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拼搏定能成功
6楼2013-01-22 09:22:10
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wangzhe163

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-21 11:19:09
T-simple的EcoRV不是T接头的位置吗？如果克隆片段进去后就没有这个酶切位点了。

这个我也不是太清楚啊
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拼搏定能成功
7楼2013-01-22 09:22:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by wangzhe163 at 2013-01-22 09:22:32
这个我也不是太清楚啊...

你有载体和所用质粒的map或者序列吧，查一下酶切位点就可以了。
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8楼2013-01-22 09:46:32
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yinchang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-22 12:03:25
wangzhe163: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-23 08:30:51
建议你用hindIII切一下线性化质粒，部分材料上说质粒的形态会影响扩增的效率。另外，今年AEM今年有篇文章专门讨论定量扩增效率的，建议你看一下，我阅读的结论是只要有合适的分析方法，没有必要过分纠结于扩增效率，文章地址如下：http://aem.asm.org/content/early/2012/04/02/AEM.07878-11.short
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9楼2013-01-22 10:37:55
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wangzhe163

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-22 09:46:32
你有载体和所用质粒的map或者序列吧，查一下酶切位点就可以了。...

载体map是确定过的，
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拼搏定能成功
10楼2013-01-23 08:26:47
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