应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR无任何条带，完全是空白胶
161/2返回列表12下一页
查看: 4474  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

武荷花S

新虫 (小有名气)

[求助] PCR无任何条带，完全是空白胶

我最近做PCR时，模板是基因组，电泳图除了Marker外，其他的一丁点条带都没有，完全是空白胶。我把所有体系全换新的，仍然没有，现在怀疑是引物问题，想验证下引物。打算用高浓度的琼脂胶（3%）来跑胶，能验证吗？





[ Last edited by 武荷花S on 2011-5-29 at 22:25 ]
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-05-29 22:07:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

syn1985

木虫 (正式写手)
连引物二聚体都没有，引物的问题可能性比较大
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2011-07-11 19:18:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
　　Mg2 浓度：Mg2 离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
　　反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
　　物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
　　靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2012-05-18 13:17:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

楼主给的信息太少，不知你的模板是什么，我首先想到的是你的PCR模板质量如何？引物是参照什么去合成的还是借用别人的，
赞一下 回复此楼
2楼2011-05-29 23:19:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

andy99990000

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 很好 2011-05-30 08:28:39
武荷花S(金币+3): 2011-05-30 20:04:08
楼主的图里有阴性对照吗？如果已包括的话，可以排除PCR体系污染的可能，那么很明显你的PCR没有正常工作，可能的原因很多，以个人经验，楼主可以尝试以下几个检测方法：

1. 用实验室一定工作的引物扩增你的DNA,这样能够看出除你的引物以外其他试剂是否工作正常。
2. 确定是引物的问题后还有2种可能：
（1）你的PCR条件不适。按你的图来看，完全没工作，可以试试降低退火温度，做touchdown，或者增加Mg离子浓度及循环次数等。
（2）如果以上全试过还是不工作，那么很大程度上就是你的引物设计或者合成的问题了。解决方法就是重新设计或者合成，呵呵，废话了。

个人经验，希望有所帮助~~
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2011-05-30 00:23:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eydalhm

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): 鼓励交流 2011-05-30 08:28:57
我认为可能原因有：1.PCR引物问题，那就要换引物·~这个我还没碰见过。
                  2.PCR所用模板DNA浓度低了或者扩增效率不够，这种情况下，你适量增加几个（3-5）循环可能就有条带了·~有时候扩增效率低的话就会这样·~
赞一下(1人) 回复此楼
飞跃寄托梦想
4楼2011-05-30 01:42:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eydalhm

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1949stone: 低温p出来在往上调 2011-05-30 21:05:01
恩，漏了一句，我觉得那些温度啊什么的条件其实差不了太多，引物合成单子上提供的温度就差不多了·~
赞一下(1人) 回复此楼
飞跃寄托梦想
5楼2011-05-30 01:44:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

myco_lei

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

应该是没有P出来，
赞一下 回复此楼
享受，把握现在！
6楼2011-05-30 17:08:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

武荷花S

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by andy99990000 at 2011-05-30 00:23:51:
楼主的图里有阴性对照吗？如果已包括的话，可以排除PCR体系污染的可能，那么很明显你的PCR没有正常工作，可能的原因很多，以个人经验，楼主可以尝试以下几个检测方法：

1. 用实验室一定工作的引物扩增你的DNA, ...

谢谢你的建议。图中没有阴性对照。我又用该模板，用其他引物进行扩增，其中此时用的引物以前都能P出来条带，所有的东西我全换成新的，PCR程序设置也没有问题，模板重新跑胶，还是可以的，可还是这种现象，这到底什么问题，实验又找不到原因了？
赞一下 回复此楼
7楼2011-05-30 20:10:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

武荷花S

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by andy99990000 at 2011-05-30 00:23:51:
楼主的图里有阴性对照吗？如果已包括的话，可以排除PCR体系污染的可能，那么很明显你的PCR没有正常工作，可能的原因很多，以个人经验，楼主可以尝试以下几个检测方法：

1. 用实验室一定工作的引物扩增你的DNA, ...

后来的反应 均加了空白对照 还是这种现象
赞一下 回复此楼
8楼2011-05-30 20:11:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

武荷花S

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by cellline at 2011-05-29 23:19:18:
楼主给的信息太少，不知你的模板是什么，我首先想到的是你的PCR模板质量如何？引物是参照什么去合成的还是借用别人的，

谢谢你的回复。模板就是基因组，上样量起初是20ng/25vl，后来模板进行稀释，做的梯度，结果一样。引物是根据已有的序列，自己设计的。
赞一下 回复此楼
9楼2011-05-30 20:15:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tonghua9700

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 武荷花S at 2011-05-30 20:10:40:
谢谢你的建议。图中没有阴性对照。我又用该模板，用其他引物进行扩增，其中此时用的引物以前都能P出来条带，所有的东西我全换成新的，PCR程序设置也没有问题，模板重新跑胶，还是可以的，可还是这种现象，这到 ...

从你的照片上可以看出，你的PCR反应没有正常进行，也就是没有扩增产物，或者扩增产物非常少，检测不到。继续靠改变胶的浓度，不会有效果。关键是寻找你的PCR反应体系哪个地方出错了！
赞一下 回复此楼
10楼2011-05-31 15:04:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 武荷花S 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭