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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 为啥RT-PCR的空白对照也出现了目的条带？
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

[求助] 为啥RT-PCR的空白对照也出现了目的条带？ 已有2人参与

做RT-PCR时，为了保证不是RNA的质量问题引起的失败，在反转录时就做了空白对照，在一组PCR管中加的是无菌水代替RNA，其余条件均不变，最后用两组实验合成的cDNA做模板，进行PCR反应，反应体系及程序完全一样，最后扩增的结果如图一。左一和左三是加了RNA的，左二和左四是加无菌水代替RNA的，右一是marker，奇怪的是我的目的条带大概就在1000，这个结果差不多正确，1500bp的marker，但为啥加了无菌水代替RNA的也能出目的条带？
    而且，楼主当时举得marker有些没有跑开，把胶又拿回去跑，最后再进行检测，就出现了图二，左二和左四降解比较明显。
    对于这种结果，我真是醉了，现在完全不知道问题出在哪里，请求各位大神支招，谢谢！

为啥RT-PCR的空白对照也出现了目的条带？
2014.10.13PCR结果.jpg


为啥RT-PCR的空白对照也出现了目的条带？-1
2014.10.13PCR延长电泳时间后的结果.jpg
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
1楼 2014-10-13 15:16:16
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cnzpli

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-10-13 22:09:52
气溶胶污染。一些较常用的载体很容易产生气溶胶污染。我们实验室跑某些基因只要加了酶和引物就可以扩出来阳性条带。建议跑PCR之前对超净台和水彻底照紫外
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2楼2014-10-13 17:08:27
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上
引用回帖:
2楼: Originally posted by cnzpli at 2014-10-13 17:08:27
气溶胶污染。一些较常用的载体很容易产生气溶胶污染。我们实验室跑某些基因只要加了酶和引物就可以扩出来阳性条带。建议跑PCR之前对超净台和水彻底照紫外

能说跑胶都是在无菌台下开着紫外灯，把线弄出来跑的吗?就是怕污染，所以每个步骤很超级严格的。那这样出来的阳性条带可靠吗？
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
3楼2014-10-13 18:03:12
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cnzpli

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by wu-ke-da at 2014-10-13 18:03:12
能说跑胶都是在无菌台下开着紫外灯，把线弄出来跑的吗?就是怕污染，所以每个步骤很超级严格的。那这样出来的阳性条带可靠吗？...

有可能反转录时空白被污染了
你跑胶上样量有点大哦 可能会飘到旁边孔的 pcr加3到5微就够了

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4楼2014-10-13 18:51:52
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上
引用回帖:
4楼: Originally posted by cnzpli at 2014-10-13 18:51:52
有可能反转录时空白被污染了
你跑胶上样量有点大哦 可能会飘到旁边孔的 pcr加3到5微就够了
...

哦，一般上5ul，如果是被污染的话，我直接切胶回收应该没什么问题吧
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
5楼2014-10-13 21:04:19
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cnzpli

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
wu-ke-da(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-14 10:55:11
引用回帖:
5楼: Originally posted by wu-ke-da at 2014-10-13 21:04:19
哦，一般上5ul，如果是被污染的话，我直接切胶回收应该没什么问题吧...

想知道到底是什么的话就分别切下来连接到通用载体上测序 结果都是你的目的片段的话就肯定是污染了

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2014-10-13 23:45:46
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上
引用回帖:
6楼: Originally posted by cnzpli at 2014-10-13 23:45:46
想知道到底是什么的话就分别切下来连接到通用载体上测序 结果都是你的目的片段的话就肯定是污染了
...

好吧，只能这样了，虽然过程有点漫长
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7楼2014-10-14 11:09:14
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ting8907

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
8楼2014-10-29 17:36:10
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上
引用回帖:
8楼: Originally posted by ting8907 at 2014-10-29 17:36:10
楼主你的结果处理的怎么样了呢？什么原因呢？我们也出现了类似的情况。。。

中间带本科实验耽误了一段时间，最近开始做，发现了更纠结的问题，条带都变下了，建议赶紧回收，送去测序就知道了，别再纠结了，相当于就多检测一个样，我就是犹豫了，弄得现在之前的条带都p不出来了
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
9楼2014-10-30 08:34:05
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ting8907

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
10楼2014-10-30 10:03:26
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