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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr开始有条带，后来怎样都没条带 已有4人参与

pcr扩增2500bp片段。开始有条带，平行两管，一管有一管没有，之后同样的条件，怎样都没有条带了，更换模板（将质粒换为gene组），重新稀释引物，酶，buffer，h2o2其他人用都没有问题，换人配置体系都没有用，就是没有目的条带。偶尔会出现杂带大概在250bp到1000bp之间的杂带，但是要是引物二聚体的话又有点太大了，亲们有没有出现过这种情况，指导一下。tm=60多，退火温度为55,54,53，延伸1min10s，1min30s都试了。
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1楼 2014-04-03 15:48:37
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-04-03 16:34:35
1. 你之前从质粒上能P出来，质粒还有么，要不然用质粒做个正对照？质粒能P出来，基因组P不出来，可能是基因组的质量不太好。
2. 你做的时候带上一个你能做出PCR的正对照，表明你一次操作的正确性。
3. 换Taq酶试试，看看是不是你的酶问题（因为Taq酶的保真性不高），看看能不能P出来，如果能，建议直接换NEB 的 phusion做PCR，我用过的PCR酶中，phusion的保真性和扩增效率相对其他而言都是最好的。
希望对你有帮助！
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2楼2014-04-03 15:57:44
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒应该更容易扩增出目的片段，你用你的质粒做模板做个梯度PCR看看能不能出有没有出目的带的，若梯度没出估计你第一次出带有可能有污染。
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hehe
3楼2014-04-03 17:08:11
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-04-03 17:08:11
质粒应该更容易扩增出目的片段，你用你的质粒做模板做个梯度PCR看看能不能出有没有出目的带的，若梯度没出估计你第一次出带有可能有污染。

第一次的条带位置就是在2500bp附近，污染有可能这么巧吗？
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4楼2014-04-04 14:36:36
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by d00614028 at 2014-04-03 15:57:44
1. 你之前从质粒上能P出来，质粒还有么，要不然用质粒做个正对照？质粒能P出来，基因组P不出来，可能是基因组的质量不太好。
2. 你做的时候带上一个你能做出PCR的正对照，表明你一次操作的正确性。
3. 换Taq酶试试 ...

我之后也用质粒做模板做过，同样的程序也扩增不出来。我后来做了对照，分别以基因组，质粒，之前pcr产物，水做了四组，程序什么的都没变，结果都没有目的条带，而且除了以pcr产物为模版的那组有大概在靠近1000bp的位置有条模糊的条带外，其他的条带都一样，是在250bp上面一条，下面一条，连用水做空白对照的那组也是。这是什么原因呢？
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5楼2014-04-04 14:41:24
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子
楼主问题解决了没有 ，我现在PCR大概也是这么长的片段，同样的出现了250BP左右这样大小的带。同样的 在100bp左右有一条杂带 。同时目的条带也有出现。请问这个杂带是什么原因？
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麻辣王子不爱做实验
6楼2015-07-20 20:51:12
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

应该是引物的问题，反正试剂肯定是没问题了，换别人操作也不行不是引物就是模板，先考虑引物吧
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
7楼2015-07-21 10:10:43
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lf-1214

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也遇到这种情况，试着把模板量提高一下，再看看情况。
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8楼2015-09-01 16:13:06
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LYforever

新虫 (小有名气)
请问楼主后来解决了吗？我现在也是遇到这样的问题
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9楼2015-11-30 14:31:36
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