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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr开始有条带,后来怎样都没条带 已有4人参与

pcr扩增2500bp片段。开始有条带,平行两管,一管有一管没有,之后同样的条件,怎样都没有条带了,更换模板(将质粒换为gene组),重新稀释引物,酶,buffer,h2o2其他人用都没有问题,换人配置体系都没有用,就是没有目的条带。偶尔会出现杂带大概在250bp到1000bp之间的杂带,但是要是引物二聚体的话又有点太大了,亲们有没有出现过这种情况,指导一下。tm=60多,退火温度为55,54,53,延伸1min10s,1min30s都试了。
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流! 2014-04-03 16:34:35
1. 你之前从质粒上能P出来,质粒还有么,要不然用质粒做个正对照?质粒能P出来,基因组P不出来,可能是基因组的质量不太好。
2. 你做的时候带上一个你能做出PCR的正对照,表明你一次操作的正确性。
3. 换Taq酶试试,看看是不是你的酶问题(因为Taq酶的保真性不高),看看能不能P出来,如果能,建议直接换NEB 的 phusion做PCR,我用过的PCR酶中,phusion的保真性和扩增效率相对其他而言都是最好的。
希望对你有帮助!
2楼2014-04-03 15:57:44
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
质粒应该更容易扩增出目的片段,你用你的质粒做模板做个梯度PCR看看能不能出有没有出目的带的,若梯度没出估计你第一次出带有可能有污染。
hehe
3楼2014-04-03 17:08:11
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-04-03 17:08:11
质粒应该更容易扩增出目的片段,你用你的质粒做模板做个梯度PCR看看能不能出有没有出目的带的,若梯度没出估计你第一次出带有可能有污染。

第一次的条带位置就是在2500bp附近,污染有可能这么巧吗?
4楼2014-04-04 14:36:36
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by d00614028 at 2014-04-03 15:57:44
1. 你之前从质粒上能P出来,质粒还有么,要不然用质粒做个正对照?质粒能P出来,基因组P不出来,可能是基因组的质量不太好。
2. 你做的时候带上一个你能做出PCR的正对照,表明你一次操作的正确性。
3. 换Taq酶试试 ...

我之后也用质粒做模板做过,同样的程序也扩增不出来。我后来做了对照,分别以基因组,质粒,之前pcr产物,水做了四组,程序什么的都没变,结果都没有目的条带,而且除了以pcr产物为模版的那组有大概在靠近1000bp的位置有条模糊的条带外,其他的条带都一样,是在250bp上面一条,下面一条,连用水做空白对照的那组也是。这是什么原因呢?
5楼2014-04-04 14:41:24
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子

楼主问题解决了没有 ,我现在PCR大概也是这么长的片段,同样的出现了250BP左右这样大小的带。同样的 在100bp左右有一条杂带 。同时目的条带也有出现。请问这个杂带是什么原因?
麻辣王子不爱做实验
6楼2015-07-20 20:51:12
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

应该是引物的问题,反正试剂肯定是没问题了,换别人操作也不行不是引物就是模板,先考虑引物吧
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
7楼2015-07-21 10:10:43
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lf-1214

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也遇到这种情况,试着把模板量提高一下,再看看情况。
8楼2015-09-01 16:13:06
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LYforever

新虫 (小有名气)

请问楼主后来解决了吗?我现在也是遇到这样的问题
9楼2015-11-30 14:31:36
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