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美丽的家园

金虫 (正式写手)

[求助] 跑PCR,琼脂糖电泳没有条带出现

新手,还望大家指正!
真菌总DNA提取,琼脂糖(0.8%)电泳 检测,是有亮带的,PCR后检测,却无.
模板 DNA 1μL,10×PCR buffer(MgCl2 20 mmol/L) 2.50 μL,dNTPs(10 mmol/L 0.5μL,10 μmol/L的正向引物 0.5 μL,10 μmol/L反向引物0.5μL,5 U/ μL Taq DNA Polymerase 0.200 μL,加ddH2O 补足至25.00 μL。
PCR扩增条件:94℃预变性5 min,95℃变性50 s,53℃复性40 s,72℃延伸 50 s,30个循环,72℃延伸5 min。
跑PCR失败,为什么呢?
有时maker 条带很暗,不是染色剂(Gelred)剂量问题,怎么回事呢?
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mingcui1003

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 美丽的家园 at 2013-08-17 17:41:55
非常感谢,不知BSA加多少,使用多大浓度比较合适...

BSA我加的终浓度是1mg/ml,低一点应该也可以的,文献中用0.2mg/ml的比较多,真菌确实没细菌那么好P,选择的引物和模板的质量都很重要!
10楼2013-08-18 09:41:09
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普通回帖

mingcui1003

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助! 2013-08-16 22:00:06
美丽的家园: 金币+5 2013-08-17 10:00:21
PCR跑不出条带的原因有很多,反应体系中各反应物的浓度不合适,反应程序,引物,退火温度,模板的质量等等都会对结果有很大的影响,初次实验,建议做一下优化,即选择不同浓度的反应体系,不同的反应程序和退火温度都试一下,多试几次,如果模板质量没问题,选用引物合适的话,应该能做出来的!
2楼2013-08-16 21:32:06
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美丽的家园

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by mingcui1003 at 2013-08-16 21:32:06
PCR跑不出条带的原因有很多,反应体系中各反应物的浓度不合适,反应程序,引物,退火温度,模板的质量等等都会对结果有很大的影响,初次实验,建议做一下优化,即选择不同浓度的反应体系,不同的反应程序和退火温度 ...

引物、模板、酶、dNTP、Mg+等都是跑PCR的重要因素,在此基础上设计不同的浓度,退火温度没有做,我想如果有条带不清晰的话,改变一下退火温度试试,不同的反应体系变化还好,不同反应程序,退回温度,每次失败重跑很费时间,有没有比较好一些的设计方法呢
3楼2013-08-17 10:00:07
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mingcui1003

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 美丽的家园 at 2013-08-17 10:00:07
引物、模板、酶、dNTP、Mg+等都是跑PCR的重要因素,在此基础上设计不同的浓度,退火温度没有做,我想如果有条带不清晰的话,改变一下退火温度试试,不同的反应体系变化还好,不同反应程序,退回温度,每次失败重跑 ...

反应体系在合适的范围内稍微变化一下影响不大,反应程序影响是比较大的,有时文献上报道的程序你按那个做不一定做的出来,我的经验是多查几篇相关的文献,多试几个程序,总有能跑的出来的,退火温度一般的PCR仪都可以设置不同的退火温度梯度,这个试起来比较方便,还有你可以在反应体系中加适量的BSA,用来保护酶的活性,我也做过真菌,反应体系中加了BSA,基本能跑出来
4楼2013-08-17 16:33:55
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周圆圆1989

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
美丽的家园: 金币+5 2013-08-17 17:42:37
会不会浓度太小,我跑过好几次,荧光能检测出来但是琼脂糖电泳显现不出来
5楼2013-08-17 16:40:22
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美丽的家园

金虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by mingcui1003 at 2013-08-17 16:33:55
反应体系在合适的范围内稍微变化一下影响不大,反应程序影响是比较大的,有时文献上报道的程序你按那个做不一定做的出来,我的经验是多查几篇相关的文献,多试几个程序,总有能跑的出来的,退火温度一般的PCR仪都可 ...

非常感谢,不知BSA加多少,使用多大浓度比较合适
6楼2013-08-17 17:41:55
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美丽的家园

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 周圆圆1989 at 2013-08-17 16:40:22
会不会浓度太小,我跑过好几次,荧光能检测出来但是琼脂糖电泳显现不出来

荧光检测,能具体一些吗?我试过DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳,有很细的条带,但无法回收。浓度这块,不知有何高见
7楼2013-08-17 17:45:57
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周圆圆1989

木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 美丽的家园 at 2013-08-17 17:45:57
荧光检测,能具体一些吗?我试过DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳,有很细的条带,但无法回收。浓度这块,不知有何高见...

PAGE才跑出很细的条带,扩增产物太少吧,你把浓度都加大试试吧。荧光检测就是加入SYBR Green 1,它能检测DNA,你是试试吧
8楼2013-08-17 17:50:41
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美丽的家园

金虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 周圆圆1989 at 2013-08-17 17:50:41
PAGE才跑出很细的条带,扩增产物太少吧,你把浓度都加大试试吧。荧光检测就是加入SYBR Green 1,它能检测DNA,你是试试吧...

嗯,多谢!我把模板量及上样量加大,再试试
9楼2013-08-17 18:00:55
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