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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物出现杂带
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潇乾魂

金虫 (小有名气)

[求助] 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物出现杂带

我的土壤样品扩展甲烷氧化功能基因A189f-mb661b，退火温度都已经达到60°C，但还是会出现杂带，大概2000kb左右，我一直没有搞明白到底怎么回事？我做过对照，拿纯菌做，没有问题。请高手帮忙解答，谢谢！
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1楼 2011-05-24 14:58:23
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jjxcz

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-05-24 15:33:49
潇乾魂(金币+3): 我试试吧 2011-05-25 13:16:05
做个T-down PCR看下，设定退火温度55-65，每个循环降0.5度，祝你好运！
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2楼2011-05-24 15:04:38
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 支持上图 2011-05-24 15:34:11
潇乾魂(金币+1): 2011-05-26 16:45:23
哥们，电泳图贴出来先，不然没法分析，
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3楼2011-05-24 15:33:22
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1): 你可以做专家顾问 2011-05-24 21:10:04
潇乾魂(金币+2): 2011-05-26 10:30:50
设置一个温度梯度
是非特异性条带太多了，当然了也可以进行切胶纯化的。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-05-24 17:00:13
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bbwalkman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1, EPI+1): 鼓励应助 2011-05-24 21:10:11
潇乾魂(金币+3): 2011-05-26 10:31:04
1.做个温度梯度试试，看看哪个温度合适
2.改变一下循环数，看看是不是循环数太多
3.检查一下引物，错误引发是不是比较高，
4.建议传个图上来，有助于大家分析
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5楼2011-05-24 17:23:28
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潇乾魂

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-24 17:00:13:
设置一个温度梯度
是非特异性条带太多了，当然了也可以进行切胶纯化的。。。

附件图就是，出现很多，那时的退火温度是55度，升到60度后还有一些，谢谢了
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6楼2011-05-25 13:20:58
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潇乾魂

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by bbwalkman at 2011-05-24 17:23:28:
1.做个温度梯度试试，看看哪个温度合适
2.改变一下循环数，看看是不是循环数太多
3.检查一下引物，错误引发是不是比较高，
4.建议传个图上来，有助于大家分析

我已经上传图了，引物没问题，我的阳性对照很正常，后来做定量时我把循环数设为35，退火温度为60度，可是还有一些样品有杂带，谢谢帮忙
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7楼2011-05-25 13:23:55
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bbwalkman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

潇乾魂(金币+1): 2011-05-26 10:31:18
35个循环已经挺多的了，减点试试，外加看看你的水或者什么的会不会污染了，我有一次就是非特异性特别多 把灭菌水换了就没有了
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8楼2011-05-25 15:09:38
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
潇乾魂(金币+5): 2011-05-25 17:17:32
amisking(EPI+1): 鼓励应助 2011-05-25 19:52:59
amisking(金币+5): 鼓励应助 2011-05-25 19:53:08
引用回帖:
Originally posted by 潇乾魂 at 2011-05-25 13:20:58:
附件图就是，出现很多，那时的退火温度是55度，升到60度后还有一些，谢谢了

你的marker在哪里？目的条带有多大？杂带是有点多。。。
首先温度梯度是这样设计的，先看看你两条引物的Tm值，之和然后除以2；比如算下来是55度，可以上下各扩4度，比如设5个梯度，可以是51 53 55 57 59，当然了温度梯度的间距可以小一些（退火温度不是乱设置的）；

你可以按照我说的做一下，看看哪一个温度下条带最亮，杂带最少，那么就选用此温度大量进行PCR吧。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
9楼2011-05-25 15:53:01
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

潇乾魂(金币+4): 2011-05-25 17:17:49
还有你的循环数太多了，35个，要那么多干嘛？循环数越多，当然了DNA产量越高，但是非特异性条带也会增多。。。开始做温度梯度的话25个循环数足以，等你大量进行PCR的时候再设成30个循环。。。

当然了如果还是有杂带，直接切胶纯化也可以呀。。。反正就是想不同的办法保证你试验顺利进行就可以了。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
10楼2011-05-25 15:55:48
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