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潇乾魂

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[求助] 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物出现杂带

我的土壤样品扩展甲烷氧化功能基因A189f-mb661b，退火温度都已经达到60°C，但还是会出现杂带，大概2000kb左右，我一直没有搞明白到底怎么回事？我做过对照，拿纯菌做，没有问题。请高手帮忙解答，谢谢！

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1楼 2011-05-24 14:58:23

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天使托

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T.Shen

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
潇乾魂(金币+5): 2011-05-25 17:17:32
amisking(EPI+1): 鼓励应助 2011-05-25 19:52:59
amisking(金币+5): 鼓励应助 2011-05-25 19:53:08

引用回帖:

Originally posted by 潇乾魂 at 2011-05-25 13:20:58:
附件图就是，出现很多，那时的退火温度是55度，升到60度后还有一些，谢谢了

你的marker在哪里？目的条带有多大？杂带是有点多。。。
首先温度梯度是这样设计的，先看看你两条引物的Tm值，之和然后除以2；比如算下来是55度，可以上下各扩4度，比如设5个梯度，可以是51 53 55 57 59，当然了温度梯度的间距可以小一些（退火温度不是乱设置的）；

你可以按照我说的做一下，看看哪一个温度下条带最亮，杂带最少，那么就选用此温度大量进行PCR吧。。。