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高照李

木虫 (正式写手)

[求助] PCR技术求助

我在做几种昆虫的DNA线粒体DNA COI片段,目的基因大小约600-700bp,用pcr扩增COI片段,50μl的扩增反应体系是:
Premix Ex Taq   25μl
引物1(LCO1490)(20μM)1μl
引物2 (HCO2198)(20μM)1μl
模板1μl(<50ng)1μl
灭菌蒸馏水        22μl
   PCR反应程序:94℃预变性3min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸60s,共35个循环,循环结束后,72℃延伸10min。
现在只P出3种,其他的种就是p不出来(都是1个亚科的),模板浓度梯度、退火温度梯度PCR都做了,结果琼脂糖凝胶电泳检测就是没有(空白对照也做了应该不是引物的问题),不知道哪位高人能帮帮分析一下?
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能是引物匹配的不好,建议重新设计引物;如果不是这个原因,就换个保真差一些的酶试试。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2012-11-19 20:55:38
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高照李

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-19 20:55:38
可能是引物匹配的不好,建议重新设计引物;如果不是这个原因,就换个保真差一些的酶试试。

引物是通用引物,请问学长为什么要用保真差的酶呢?
3楼2012-11-19 21:30:31
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
高照李: 金币+10, 有帮助 2012-11-20 09:24:39
引用回帖:
3楼: Originally posted by 高照李 at 2012-11-19 21:30:31
引物是通用引物,请问学长为什么要用保真差的酶呢?...

保真差的酶即使有错配也能扩增出来。但也不绝对,也可能试试保真性更好的酶。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2012-11-19 22:17:13
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高照李

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-19 22:17:13
保真差的酶即使有错配也能扩增出来。但也不绝对,也可能试试保真性更好的酶。
...

谢谢学长,我试一试。
5楼2012-11-20 09:25:07
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