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高照李

木虫 (正式写手)

[求助] PCR技术求助

我在做几种昆虫的DNA线粒体DNA COI片段，目的基因大小约600-700bp,用pcr扩增COI片段，50μl的扩增反应体系是：
Premix Ex Taq   25μl
引物1（LCO1490)（20μM）1μl
引物2 (HCO2198)（20μM）1μl
模板1μl（<50ng）1μl
灭菌蒸馏水        22μl
   PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性60s，50℃退火60s，72℃延伸60s，共35个循环，循环结束后，72℃延伸10min。
现在只P出3种，其他的种就是p不出来（都是1个亚科的），模板浓度梯度、退火温度梯度PCR都做了，结果琼脂糖凝胶电泳检测就是没有（空白对照也做了应该不是引物的问题），不知道哪位高人能帮帮分析一下？
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1楼 2012-11-19 19:52:28
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是引物匹配的不好，建议重新设计引物；如果不是这个原因，就换个保真差一些的酶试试。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2012-11-19 20:55:38
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高照李

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-19 20:55:38
可能是引物匹配的不好，建议重新设计引物；如果不是这个原因，就换个保真差一些的酶试试。

引物是通用引物，请问学长为什么要用保真差的酶呢？
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3楼2012-11-19 21:30:31
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
高照李: 金币+10, ★有帮助 2012-11-20 09:24:39
引用回帖:
3楼: Originally posted by 高照李 at 2012-11-19 21:30:31
引物是通用引物，请问学长为什么要用保真差的酶呢？...

保真差的酶即使有错配也能扩增出来。但也不绝对，也可能试试保真性更好的酶。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2012-11-19 22:17:13
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高照李

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-19 22:17:13
保真差的酶即使有错配也能扩增出来。但也不绝对，也可能试试保真性更好的酶。
...

谢谢学长，我试一试。
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5楼2012-11-20 09:25:07
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