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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】目的基因PCR后电泳出现多条带
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jiangqingbin

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】目的基因PCR后电泳出现多条带

各位大虫，我用农杆菌提取的质粒DNA，然后对目的基因（450bp）进行PCR扩增，电泳后发现多条带，其中两条最为清晰，用的marker是100bp的，发现在1000bp附近也有一条很清晰地带，请问是什么原因？
我对引物重复核对了几次，并且找公司又重新合成，可还是出现这样的结果。
是不是在提DNA后RNA溶解不充分，扩增体系里DNA样本量太多跑出条带，
或者DNA模板量太少出现引物二聚体等等....
还请各位大牛帮忙指导！！多谢
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1楼 2010-09-15 12:01:13
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snowice

银虫 (小有名气)
★
jiangqingbin(金币+2): 2010-09-15 14:41:50
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-09-15 23:30:00
不会是引物二聚体，它一般都在100bp以下，升高一下退火温度，看看行不行，拿你的引物和重组质粒的序列在NCBI上Blast一下，看看有没有其他结合的地方，最后再考虑模板的问题。不行就割胶回收嘛，如果你是要pcr产物的话
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爱吃爱睡懒得要死的猪头
2楼2010-09-15 12:24:01
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zdmei

金虫 (小有名气)
★
jiangqingbin(金币+2): 2010-09-15 14:41:56
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-09-15 23:30:07
可能是引物在该质粒上有错配吧，可以适当提高退火温度。其实有你的目的条带就行，建议再对质粒做个酶切鉴定，还可以送测序但可能不太好测出来。
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3楼2010-09-15 12:32:49
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在雨中

金虫 (著名写手)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-09-15 23:30:12
jiangqingbin(金币+1): 2010-09-18 10:16:47
jiangqingbin(金币+2): 2010-10-07 12:17:13
适当提高退火温度.或者采用touchdown PCR,提高产物的特异性.
另外还要注意PCR操作时不要污染了样品.样品污染了也有可能产生非特异扩增
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4楼2010-09-15 14:59:04
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heismeng

金虫 (小有名气)
jiangqingbin(金币+1): 2010-09-18 10:16:41
这个可能是引物的问题吧 TOUCHDOWN试试 或者重新设计引物 一般情况PLASMID做模板应该很好扩吧
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5楼2010-09-15 15:03:42
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jiangqingbin

金虫 (正式写手)
scelab:图真漂亮 2010-09-15 23:30:56
引用回帖:
Originally posted by jiangqingbin at 2010-09-15 12:01:13:
各位大虫，我用农杆菌提取的质粒DNA，然后对目的基因VirD1（450bp）进行PCR扩增，电泳后发现多条带，其中两条最为清晰，用的marker是100bp的，发现在1000bp附近也有一条很清晰地带，请问是什么原因？
我对引物重复核对 ...

引物序列为：
引物1  5' ATGTCGCAAGGACGTAAGCCCA 3'
引物2  5' GGAGTCTTTCAGCATGGAGCAA 3'
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6楼2010-09-15 16:13:46
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tj_fjl

新虫 (初入文坛)
jiangqingbin(金币+1): 2010-09-18 10:16:35
模板污染，或者特异性不好，用TOUCHDOWN试试！
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7楼2010-09-16 09:19:30
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zdmei

金虫 (小有名气)
jiangqingbin(金币+1): 2010-09-18 10:16:31
看起来像是污染，有做过水对照吗？
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8楼2010-09-16 14:14:31
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