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[交流]
【求助/交流】做培养细胞的RT-PCR，β-actin内参出现两个条带，求原因。
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我进行培养细胞的RT-PCR，按试剂盒说明提取总RNA后，用一步法进行RT-PCR，用内参β-actin的引物进行，产物长度315bp，反应条件为：50摄氏度30min,94摄氏度2min，94摄氏度30s，59摄氏度30s,72摄氏度1min(上述三步进行30次），72摄氏度7分钟，然后用产物进行电泳，结果两个样本（是两瓶细胞中分别提取的总RNA)在紫外仪下均看到两个条带（见照片）。请问这是不是正常？ 另外我还有个问题请教：做RT-PCR是不是只要像这样条带出来就行了？如果要定量，是不是一个培养瓶里的细胞提出来的RNA只能算一个样本？比如我有两瓶细胞，一个做实验组加药，一个做对照组不加，两瓶细胞分别提取一份总RNA，然后各分成3份同时进行RT-PCR，最后获得6个电泳后的光度值（实验组3个，对照组3个），之后按实验组3个样本，对照组3个样本进行统计学分析。这样是不是可以？还是一定要实验组养3瓶细胞，对照组养3瓶细胞，每瓶提取1份总RNA？ 我第一次做RT-PCR，不太懂，谢谢帮助！   /*-------------------------------------以下为2月18日新增的---------------------*/ 又做了一次，从提总RNA开始，这次是正式实验，加了干预因素的，还分了时间段（上次只是走一遍整个过程）还是内参有两个条带，这次我是连目的基因一块儿做了，目的基因很好，但是内参还是有两个条带。这次我一共做了18个泳道，截图是其中4个，最左边是Marker，不太清楚，接着两条是目的基因，最右边是β-actin内参，还是有两个条带。我的问题是如果是DNA污染，应该是3个基因都有污染吧？我还有个问题：像这样的图片能定量吗？因为所有时间段的所有基因都有条带，也就是说没有空的，我问了实验室老师，实验室只能出这样的图片，出不了数据的。谢谢了。  [ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:50 ] |
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zwdnet(金币+1): 对我帮助很大，非常感谢！ 2011-02-22 12:21:56
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楼主的引物多长？如果在20边上徘徊的话估计是引物太短，特异性不够，可以考虑设计到25左右，而且可以把引物放到NCBI的引物BLAST里去BLAST一下，看是不是可以PCR出其他产物。另外可以增加退火温度，提高特异性。 如果楼主要进行统计学分析，个人认为必须3份分开提RNA，不能一起提了再分开做，不然就相当于是只有一个样本，重复3次而已。楼主要的是3个平行样本。 另外，提醒下楼主，内参的作用是用于消除模板量的差异，但是PCR的循环数和模板达到一定量时，产物的总量会达到一个平台，也就是说，模板加多加少，产物跑胶都会差不多的亮，这样楼主就会认为各体系内加入的模板数量是一样的（其实不可能一样），于是内参来消除模板量差异就无法起作用，要减少循环数，以达到内参之间的亮度有差异。 |
8楼2011-02-19 09:36:19
9楼2011-02-19 10:06:53
10楼2011-02-19 16:07:21
11楼2011-02-19 17:21:38
