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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】做培养细胞的RT-PCR，β-actin内参出现两个条带，求原因。
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zwdnet

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】做培养细胞的RT-PCR，β-actin内参出现两个条带，求原因。

我进行培养细胞的RT-PCR，按试剂盒说明提取总RNA后，用一步法进行RT-PCR，用内参β-actin的引物进行，产物长度315bp，反应条件为：50摄氏度30min,94摄氏度2min，94摄氏度30s，59摄氏度30s,72摄氏度1min(上述三步进行30次），72摄氏度7分钟，然后用产物进行电泳，结果两个样本（是两瓶细胞中分别提取的总RNA)在紫外仪下均看到两个条带（见照片）。请问这是不是正常？
另外我还有个问题请教：做RT-PCR是不是只要像这样条带出来就行了？如果要定量，是不是一个培养瓶里的细胞提出来的RNA只能算一个样本？比如我有两瓶细胞，一个做实验组加药，一个做对照组不加，两瓶细胞分别提取一份总RNA，然后各分成3份同时进行RT-PCR，最后获得6个电泳后的光度值（实验组3个，对照组3个），之后按实验组3个样本，对照组3个样本进行统计学分析。这样是不是可以？还是一定要实验组养3瓶细胞，对照组养3瓶细胞，每瓶提取1份总RNA？
我第一次做RT-PCR，不太懂，谢谢帮助！


/*-------------------------------------以下为2月18日新增的---------------------*/
又做了一次，从提总RNA开始，这次是正式实验，加了干预因素的，还分了时间段（上次只是走一遍整个过程）还是内参有两个条带，这次我是连目的基因一块儿做了，目的基因很好，但是内参还是有两个条带。这次我一共做了18个泳道，截图是其中4个，最左边是Marker，不太清楚，接着两条是目的基因，最右边是β-actin内参，还是有两个条带。我的问题是如果是DNA污染，应该是3个基因都有污染吧？我还有个问题：像这样的图片能定量吗？因为所有时间段的所有基因都有条带，也就是说没有空的，我问了实验室老师，实验室只能出这样的图片，出不了数据的。谢谢了。


[ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:50 ]
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1楼 2011-01-28 09:43:36
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流！ 2011-01-28 19:44:00
怎么没有marker啊？

这EB加的也太多了，胶都红了。。
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2楼2011-01-28 16:28:38
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zwdnet

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-01-28 16:28:38:
怎么没有marker啊？

这EB加的也太多了，胶都红了。。

marker是最左边那个，好像是100bp到400bp的，我是在电泳仪旁边的紫外仪里用自己的数码相机拍的，不是专门的拍电泳图片的设备（当时已经六点多，管拍照的老师下班了），那个紫外仪只是给人观察用的，前面有个小门，平时观察时要关门的，为了拍照只能半开着，偏红不知道是不是这个原因。谢谢。
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3楼2011-01-28 23:48:29
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-02-18 19:57:45
不是引物特异性不好，就是提取的RNA有DNA污染

marker不清晰，没法怎么判断~~
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4楼2011-01-30 09:58:54
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shaquila

金虫 (正式写手)
是不是有DNA污染～～
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5楼2011-01-30 11:05:15
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
有可能是不同剪切形式  actin是含量很多的基因  非常容易P出来  引物设计不得当都能P出来三四条呢   你试试参考文献的引物
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6楼2011-02-07 16:43:55
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zwdnet

铁虫 (初入文坛)
lstt09nk: 建议楼主把把实验结果都弄到一起，都弄到一楼最好，这样便于大家浏览 2011-02-18 20:00:11
谢谢斑竹建议，该楼挪到1楼了。

[ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:47 ]
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7楼2011-02-18 12:45:27
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)
zwdnet(金币+1): 对我帮助很大，非常感谢！ 2011-02-22 12:21:56

楼主的引物多长？如果在20边上徘徊的话估计是引物太短，特异性不够，可以考虑设计到25左右，而且可以把引物放到NCBI的引物BLAST里去BLAST一下，看是不是可以PCR出其他产物。另外可以增加退火温度，提高特异性。
如果楼主要进行统计学分析，个人认为必须3份分开提RNA，不能一起提了再分开做，不然就相当于是只有一个样本，重复3次而已。楼主要的是3个平行样本。
另外，提醒下楼主，内参的作用是用于消除模板量的差异，但是PCR的循环数和模板达到一定量时，产物的总量会达到一个平台，也就是说，模板加多加少，产物跑胶都会差不多的亮，这样楼主就会认为各体系内加入的模板数量是一样的（其实不可能一样），于是内参来消除模板量差异就无法起作用，要减少循环数，以达到内参之间的亮度有差异。
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8楼2011-02-19 09:36:19
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张力民1598

铜虫 (小有名气)

我觉得应该用三瓶细胞做实验，还有出现两条带的原因可能是引物特异性不好或有DNA污染
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9楼2011-02-19 10:06:53
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zwdnet

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 阿修罗Axuro at 2011-02-19 01:36:19:
楼主的引物多长？如果在20边上徘徊的话估计是引物太短，特异性不够，可以考虑设计到25左右，而且可以把引物放到NCBI的引物BLAST里去BLAST一下，看是不是可以PCR出其他产物。另外可以增加退火温度，提高特异性。
...

多谢！引物长度就是18bp的19bp,3个基因差不多都是这样。blast我在研一设计引物的时侯就做过了，这是截图

如果我要定性，就是证明细胞里有这两种基因表达，内参是不是不重要？唉，没办法，6月份就毕业了，还要找工作。我学医的，将来可不是靠科研吃饭。
我改改退火温度(实验中为59摄氏度）和循环次数（实验中为30次）看看吧，谢谢帮助！

[ Last edited by zwdnet on 2011-2-19 at 16:13 ]
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10楼2011-02-19 16:07:21
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)

我说的BLAST是引物BLAST，你把两条引物放进去，BLAST后，可以给你分析出可能会PCR出哪些基因。恩，如果只是定性的话，内参基本不重要，内参是用于RT-PCR半定量时用的，我所说的循环数影响也只是在半定量时有用。
18   19的话PCR  mRNA还是有点少，如果PCR质粒的话  15都没问题，但是mRNA中含的基因太多，18  19的话特异性有点低了 建议23以上的话比较好，每多一个碱基理论上特异性提高四倍。
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11楼2011-02-19 17:21:38
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