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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助~~~~~PCR产物条带分析
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c_yl

银虫 (初入文坛)

[求助] 求助~~~~~PCR产物条带分析

我做的是PCR温度梯度，反向引物设计了两个，图片上六个条带两个两个是一组，总共三组，但是疑惑的是第四个条带怎么突然很亮，而且还不知道哪个温度比较适合

79 条件 3.27.jpg
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1楼 2013-03-29 19:07:05
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回帖置顶 ( 共有1个 )

樱桃小杏子

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-04-02 20:55:51
gyesang: 回帖置顶 2013-05-02 12:09:53
c_yl: 金币+9, ★有帮助 2013-06-15 14:01:53
额网上找的楼主将就看看 降落PCR（即touchdown PCR）是一种增加PCR反应特异性的优化方法。一般情况下，解决PCR非特异性扩增的方法是通过调整Mg++浓度或改变退火温度等来实现的，但这些方法既烦琐又耗时，Touchdown PCR利用一种简单的手段克服了这些复杂的问题。其基本原理是：设计多循环反应程序以使相连循环的退火温度越来越底。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平。这个策略有利于确保第一个引物摸板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些生产目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异性杂交的Tm值，但此时目的扩增物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异）PCR产物的地位。由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在Touchdown PCR中，必须应用热启动技术（hotstart）。编设Touchdown PCR程序的目的是要涉及一系列退火温度越来越低的循环，退火温度的范围应该跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃左右。例如：如果一对引物的计算Tm值为63℃，可设定PCR仪的退火温度从66℃降到50℃（每两个循环降低退火温度1℃），再在50℃退火温度下做15个循环。如果在Touchdown PCR中，持续出现假象带表明起始退火温度太低，或者目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，和（或）非目的扩增物以更高的效率扩增。把退火温度每降低1℃时所需要的循环数增加到3或4，有可能在非目的产物开始扩增以前给目的产物增加竞争优势。这时，应从程序的末尾去掉相应的循环数，以避免过度循环扩增产物的降解和产生高分子量成片产物。
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╭(╯^╰)╮
9楼2013-03-31 10:30:24
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

c_yl

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小科研女dow at 2013-03-29 20:13:17
其实做实验 目的达到就好
不必要非选出最佳的温度
你可以直接做一个touchdown来P你的条带
检测出结果如果条带很亮就说明你P的浓度高
但是确实也不影响你后续的实验吧
你这个突然很亮的原因我猜测也不一定就是温 ...

什么是touchdown？新手，不懂。。。
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8楼2013-03-31 09:53:19
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普通回帖

小科研女dow

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-03-30 03:58:38
其实做实验 目的达到就好
不必要非选出最佳的温度
你可以直接做一个touchdown来P你的条带
检测出结果如果条带很亮就说明你P的浓度高
但是确实也不影响你后续的实验吧
你这个突然很亮的原因我猜测也不一定就是温度低呃影响 毕竟3号不一样
所以可能就是偶然性结果导致的  比如说这管的酶的浓度刚好是下层的没有混匀导致酶多产物浓度高
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做出色的科研人
2楼2013-03-29 20:13:17
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爱上文慧

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你有没有感觉3、4泳道还有微弱的杂带？是不是退火温度太低了出现的非特异性条带？
分子实验偶然性太大了，郁闷!
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每一个你讨厌的现在都有一个不努力的曾经
3楼2013-03-29 21:57:31
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匿名

用户注销 (小有名气)
★
感谢参与，应助指数 +1
c_yl(gyesang代发): 金币+1, 鼓励帮助楼主分析问题！ 2013-05-01 21:00:57
本帖仅楼主可见
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4楼2013-03-29 22:34:58
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Leo_xin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-02 12:03:24
记得点一个marker。。。不然怎么知道你的条带是多大， 你就几个产物一点， 可能是什么都没P出来 ，  仅仅是引物二聚体。。。而3，4上面两个微弱的条带却是？？？？
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还有太多地方值得改进。
5楼2013-03-30 23:06:36
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小丫丫———

新虫 (初入文坛)
3,4条带那些微弱的条带很有可能是非特异性结合的杂带，分子实验偶尔性太大了，每一次做的结果都不一样，建议一次性多做几个样本，选择适合的温度
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6楼2013-03-31 09:37:12
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c_yl

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lily7a26 at 2013-03-29 22:34:58
看溴酚蓝的位置在很上面，说明条带分子量很小，电泳电压低，导致样品弥散，条带我怀疑是引物二聚体，而非目的条带。建议先跑touchdown，确定引物能够跑出来，再慢慢摸索具体的温度。

什么是touchdown？新手，不懂。。。
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7楼2013-03-31 09:53:13
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lchxia2001

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

先降低模板量观察完实验现象后，再确定下一步该做什么
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10楼2013-04-02 19:37:21
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