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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】如何对PCR测序产物进行分析？
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350784478

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】如何对PCR测序产物进行分析？ 已有8人参与

最近在做某一基因的RT-PCR反应，取得了进展。产物送去测序，已将测序结果发给我了，但是我不知道如何从测序峰图中看出是否有突变?
我晓得最简单的办法就是对碱基序列进行对照，但是由于碱基数较多，，所以操作起来比较麻烦，不知道是否有较简单的方法？
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朝为田舍郎，暮登天子堂。将相本无种，男儿当自强。
1楼 2011-01-29 14:44:45
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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dhd997(金币+2): good 2011-01-30 18:59:24
用软件进行比对啊
经典的bioedit到什么dnaman之类的都可以
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2楼2011-01-29 17:58:17
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phoenix211

金虫 (小有名气)
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dhd997(金币+2): 谢谢交流 2011-01-30 19:00:33
用软件做就好了啊，我一般用DNAMAN和Clustal Raindy。非常方便。
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3楼2011-01-29 23:41:22
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guoxingjun2008

金虫 (正式写手)
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dhd997(金币+3): good 2011-01-30 19:00:57
对头，但是不知道你是不是双向测序，如果是双向测序的话要用拼接软件拼接后再比对。
   另外我提醒一下你，不知道你PCR的时候用的普通Taq酶还是高保真Taq酶，如果是普通Taq酶的话，看突变是不科学的，因为普通Taq酶保真性不好，有渗入错误碱基的可能，所以最好是用Pfu！
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4楼2011-01-30 14:49:01
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350784478

木虫 (正式写手)
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Originally posted by guoxingjun2008 at 2011-01-30 14:49:01:
对头，但是不知道你是不是双向测序，如果是双向测序的话要用拼接软件拼接后再比对。
   另外我提醒一下你，不知道你PCR的时候用的普通Taq酶还是高保真Taq酶，如果是普通Taq酶的话，看突变是不科学的，因为普通Ta ...

你好！我是单向的，且不是用高保真的Taq酶。我的目的产物是1060bp，但是测出来才990bp，我对了半天，也没有发现测序结果和我的基因序列结合。郁闷！
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朝为田舍郎，暮登天子堂。将相本无种，男儿当自强。
5楼2011-01-30 20:55:31
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350784478

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by phoenix211 at 2011-01-29 23:41:22:
用软件做就好了啊，我一般用DNAMAN和Clustal Raindy。非常方便。

你好！我是第一次做这个，我还想多问一下，我可以用这个软件来找测序结果与所做基因的同源性吗？即可以用这个软件来找测序结果在基因中的位置吗？
如果可以，如何操作呢？
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朝为田舍郎，暮登天子堂。将相本无种，男儿当自强。
6楼2011-01-30 21:10:10
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phoenix211

金虫 (小有名气)
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Originally posted by 350784478 at 2011-01-30 20:55:31:

你好！我是单向的，且不是用高保真的Taq酶。我的目的产物是1060bp，但是测出来才990bp，我对了半天，也没有发现测序结果和我的基因序列结合。郁闷！

有时候你得把测序得到的序列转换下，换成互补序列、反向序列还有反向互补序列来比对下。
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7楼2011-01-31 23:20:21
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pop_hjx_41

铜虫 (初入文坛)
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不知道你是在哪里测得还是自己测得 我送到华大测序 感觉如果是900左右的话 单向测序可能后面的就很不准了 如果不结合的话 是不是p出的是非特异性结合呢？
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8楼2011-02-03 22:37:05
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guoxingjun2008

金虫 (正式写手)
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Originally posted by 350784478 at 2011-01-30 20:55:31:

你好！我是单向的，且不是用高保真的Taq酶。我的目的产物是1060bp，但是测出来才990bp，我对了半天，也没有发现测序结果和我的基因序列结合。郁闷！

1060bp比较长了，单向肯定是不准的，建议用双向拼接后会准确很多，同时用高保真酶，完了再加A反应，之后就可以连接T载体，这样测序既准确也能保证不会人为渗入突变碱基。  
    同时，如果和原序列比对不上的话，可以把拼接的序列弄成反向或者是反向互补再比对！
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9楼2011-02-10 09:42:48
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caicai6014

金虫 (正式写手)
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blast ,在网站上可以直接比对，需要的话我发个说明给你
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caicai6014
10楼2011-02-10 11:49:40
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