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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【问题反馈】一对引物扩出来的产物测序后竟然是很多质粒的PCR产物，再怎么区分呢？
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xulu2008

金虫 (正式写手)

[交流] 【问题反馈】一对引物扩出来的产物测序后竟然是很多质粒的PCR产物，再怎么区分呢？ 已有8人参与

一对引物扩出来的产物测序后竟然是很多质粒的PCR产物，再怎么区分呢？怎么样才能找到我需要的质粒的特异的地方，望各位高手指教，小弟在此谢过了！！！
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1楼 2010-08-03 21:46:55
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louli

铜虫 (小有名气)
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-05 06:01:53
你的意思是不是扩出来的序列与很多的载体在相似序列啊，那是很正常的，因为你的目的片段是连在载体上的 ，测序的时候必然要多测一些。 你P的是已知序列吗，如果是已知序列，你可以直接在NCBI上把两个序列一起比对就行了，这样比较准确。
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2楼2010-08-04 06:55:48
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liouwzh

木虫 (正式写手)
★
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可能是连接的时候出现了假阳性。
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3楼2010-08-04 09:26:46
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cpu2004

金虫 (小有名气)
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-05 06:02:10
说的不是很清楚，难道是直接测的PCR产物？正常转化挑菌每个菌落应该是单克隆的。不管怎么说首先要注意的是你的引物扩增的特异性问题，最起码你应该是琼脂糖电泳是单一条带，还有的问题要看你到底是啥目的和具体方案了
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4楼2010-08-04 11:17:55
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-08-05 06:02:18
很简单，把你的质粒重新转化e.coli，然后挑单克隆，菌落PCR，将只有单一条带的聚落摇菌提质粒测序
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5楼2010-08-04 12:31:04
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cheo163

金虫 (小有名气)
★
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你的意思是说你的模板不纯，是杂的吗？
这样ls的方法就可以了
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6楼2010-08-04 14:56:55
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
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楼主说的不清楚
是PCR产物测序，还是PCR产物克隆后测序？
目的片段是什么？需要的质粒的特异的地方是什么意思？

楼主是克隆测序的话，应该将载体序列去掉后，再进行比对，那样就没有那么多质粒片段了
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7楼2010-08-04 15:28:29
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xulu2008

金虫 (正式写手)
谢谢各位了
我的表述不是很清楚，我再表述下啊
我是想用简单的pcr方法能够检测一个微生物群落中的RP4或RK2质粒？或者有没有更好的方法来检测。
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8楼2010-08-04 21:21:54
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cpu2004

金虫 (小有名气)
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reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-08-05 06:02:33
你要先找到RP4或RK2质粒的特征区域作为PCR的对象，而且为了准确往往需要多对引物都能P出特征条带
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9楼2010-08-04 23:06:17
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xulu2008

金虫 (正式写手)
谢谢，由于RP4和PK2的核酸有好几万，这样的特征区域有没有比较好的方法可以寻找出来，由于相关文献的报道比较少所以还不能直接从文献中寻得。
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10楼2010-08-05 15:05:29
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