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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】分子克隆后M13引物PCR扩增
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-超越beyond

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】分子克隆后M13引物PCR扩增

我用的载体是pMD 19  ,插入片段是16S，挑克隆后用通用M13引物扩增，结果死活扩不出来，快急死我了，大家有没有同样的情况。这应该怎么办啊
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1楼 2011-03-18 10:15:28
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
-超越beyond(金币+1): 谢谢 2011-03-19 17:04:16
重新挑取克隆试试。
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2楼2011-03-18 10:34:58
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-超越beyond

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-03-18 10:34:58:
重新挑取克隆试试。

重新挑了还是不行啊
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3楼2011-03-18 10:59:57
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振子

新虫 (小有名气)

你好

-超越beyond(金币+1): 谢谢 2011-03-19 17:04:05
你所谓的扩不出来是没有阳性是吧？
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4楼2011-03-18 11:39:01
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zqhao2003

新虫 (初入文坛)
★
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-19 09:34:38
-超越beyond(金币+1): 谢谢 2011-03-19 17:03:54
-超越beyond(金币+1): 谢谢 2011-03-20 17:18:27
楼主是用的下面这对引物吗？可以用这对引物试试，Tm 55或53都可以。
M13F(-47)        CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
M13R(-48)        AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
我们一般测序都是用这对引物的，很好用，扩PCR应该没有问题。
祝好运
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5楼2011-03-19 00:02:56
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zqhao2003

新虫 (初入文坛)
★
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-19 09:35:00
-超越beyond(金币+1): 2011-03-19 17:03:38
如果这对通用引物没有 可以找测序公司要一点 一般测序公司会免费提供一些的。如果客户需要，我们公司一般会为客户一些通用引物用了扩PCR验证。
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6楼2011-03-19 00:06:25
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
★
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-19 09:35:09
-超越beyond(金币+1): 谢谢 2011-03-20 17:18:08
应该多挑几个克隆，有假阳性存在，比如有杂菌污染，或者16S根本没连上载体，实在不行楼主重连吧，少加点载体
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7楼2011-03-19 07:08:45
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smiled001

禁虫 (小有名气)
-超越beyond(金币+1): 谢谢 2011-03-20 17:17:45
本帖内容被屏蔽
8楼2011-03-19 13:22:08
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chenshuai1238

金虫 (初入文坛)
-超越beyond(金币+1): 谢谢 2011-03-20 17:17:37
我怀疑可能是酶切后把引物切坏了，引物不会再连在质粒上，而菌落PCR上
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9楼2011-03-19 13:53:38
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zhangby2002

银虫 (小有名气)
-超越beyond(金币+1): 谢谢 2011-03-20 17:17:54
引用回帖:
Originally posted by -超越beyond at 2011-03-18 10:15:28:
我用的载体是pMD 19  ,插入片段是16S，挑克隆后用通用M13引物扩增，结果死活扩不出来，快急死我了，大家有没有同样的情况。这应该怎么办啊

我也是做分子克隆的，我认为片段是否连接载体上，电泳看下。另外多挑几个克隆，防止假阳性，也可以做下双酶切鉴定看看是否阳性克隆。
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10楼2011-03-19 16:07:24
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-超越beyond

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 振子 at 2011-03-18 11:39:01:
你所谓的扩不出来是没有阳性是吧？

是菌体扩增后没有 扩增产物
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11楼2011-03-19 16:46:39
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-超越beyond

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 振子 at 2011-03-18 11:39:01:
你所谓的扩不出来是没有阳性是吧？

菌体扩增没有扩增产物
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13楼2011-03-19 16:49:33
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-超越beyond

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by smiled001 at 2011-03-19 13:22:08:
我也是用的这个，用RV-M和目的基因下游引物做菌液PCR扩不出来
提质粒后目的基因特异性引物p，蓝斑也扩出来了，不知道咋回事

确实挺怪异
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14楼2011-03-19 16:55:41
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-超越beyond

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhangby2002 at 2011-03-19 16:07:24:
我也是做分子克隆的，我认为片段是否连接载体上，电泳看下。另外多挑几个克隆，防止假阳性，也可以做下双酶切鉴定看看是否阳性克隆。

确定片段连上了，因为菌液扩增片段上的一小段序列为扩增阳性
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15楼2011-03-19 16:57:56
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-超越beyond

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhangby2002 at 2011-03-19 16:07:24:
我也是做分子克隆的，我认为片段是否连接载体上，电泳看下。另外多挑几个克隆，防止假阳性，也可以做下双酶切鉴定看看是否阳性克隆。

检测过了是阳性。我先用片段内的引物检测为阳性后才做M13扩增的，确定是阳性
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16楼2011-03-19 17:01:40
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taigongzaici

新虫 (小有名气)
1,M13F 和M13R，M13-47和M13-48都可以试试
2.酶切鉴定
3.换个公司测序
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17楼2011-03-19 20:16:11
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_然然

金虫 (正式写手)
-超越beyond(金币+1): 谢谢 2011-03-20 17:15:59
引用回帖:
Originally posted by -超越beyond at 2011-03-18 10:15:28:
我用的载体是pMD 19  ,插入片段是16S，挑克隆后用通用M13引物扩增，结果死活扩不出来，快急死我了，大家有没有同样的情况。这应该怎么办啊

你的载体是t载体，请问您是怎么获得的片段 用什么酶扩的，只有pcr扩出来才可能连到载体上
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18楼2011-03-19 23:17:50
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-超越beyond

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by _然然 at 2011-03-19 23:17:50:
你的载体是t载体，请问您是怎么获得的片段 用什么酶扩的，只有pcr扩出来才可能连到载体上

Tag酶扩的，16S片段
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19楼2011-03-20 17:15:44
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vs570588

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不可能扩不出来，你的意思是菌落PCR后，电泳没有条带吗？
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20楼2011-03-20 20:42:09
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-超越beyond

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by vs570588 at 2011-03-20 20:42:09:
不可能扩不出来，你的意思是菌落PCR后，电泳没有条带吗？

是的电泳没有条带
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21楼2011-03-21 14:43:37
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vs570588

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by -超越beyond at 2011-03-21 14:43:37:
是的电泳没有条带

阳性克隆也没有条带吗？如果真是这样的话，那就是药品的是。不过不应该呀。就算假阳性也应该有条带呀
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22楼2011-03-21 19:01:27
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djrhewc

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by zqhao2003 at 2011-03-19 00:02:56:
楼主是用的下面这对引物吗？可以用这对引物试试，Tm 55或53都可以。
M13F(-47)        CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
M13R(-48)        AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
我们一般测序都是用这对引物的，很好用，扩PCR应该没有问题。
祝 ...

这个和M13F & M13R不一样吧？~pEASY-T1的引物
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23楼2011-03-22 00:28:04
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-超越beyond

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by vs570588 at 2011-03-21 19:01:27:
阳性克隆也没有条带吗？如果真是这样的话，那就是药品的是。不过不应该呀。就算假阳性也应该有条带呀

阳性克隆也没有条带，很怪异的事情
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24楼2011-03-22 16:19:47
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zqhao2003

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by djrhewc at 2011-03-22 00:28:04:
这个和M13F & M13R不一样吧？~pEASY-T1的引物

peasy-t1正向引物M13R:CAGGAAACAGCTATGACC
           反向引物有两条一条是M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT
          另一条是T7：TAATACGACTCACTATAGG
          两条引物都可以用来测序或扩PCR验证
载体图谱请见附件。

祝实验顺利！
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25楼2011-03-24 00:42:38
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duanhs

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
这种情况我们实验室也遇到了，很奇怪，不知道楼主现在解决了么？知道原因了可否分享一下？？
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26楼2011-07-07 08:46:02
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1989青苹果

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
767453楼: Originally posted by -超越beyond at 2011-03-18 10:15:28
我用的载体是pMD 19  ,插入片段是16S，挑克隆后用通用M13引物扩增，结果死活扩不出来，快急死我了，大家有没有同样的情况。这应该怎么办啊

你好，我也遇到和你一样的问题，请问你是怎么解决的？
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27楼2013-01-12 20:58:04
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堍仔

至尊木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
同问，我还有个问题，就是我能扩出来，但是测序测不出来，是什么原因啊
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28楼2013-01-15 09:17:32
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-超越beyond

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
1301329楼: Originally posted by duanhs at 2011-07-07 08:46:02
这种情况我们实验室也遇到了，很奇怪，不知道楼主现在解决了么？知道原因了可否分享一下？？

克隆废掉以后重新挑的克隆，摇菌时培养基用的是进口的胰蛋白
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29楼2013-01-17 11:39:52
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-超越beyond

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
1372835楼: Originally posted by 堍仔 at 2013-01-15 09:17:32
同问，我还有个问题，就是我能扩出来，但是测序测不出来，是什么原因啊

测序引物不对？
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30楼2013-01-17 11:40:21
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lixing4111

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可能是本身pcr出来的浓度不够，没有连上，加上有假阳性的可能。多做几次就会出来了，要是觉得检测假阳性太麻烦，可以用蓝白斑加上挑菌落pcr检测。不行可以双酶切检测。
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31楼2013-01-23 10:38:23
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fangyuanpan

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by zqhao2003 at 2011-03-19 00:02:56
楼主是用的下面这对引物吗？可以用这对引物试试，Tm 55或53都可以。
M13F(-47)        CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
M13R(-48)        AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
我们一般测序都是用这对引物的，很好用，扩PCR应该没有问题。
祝好 ...

请问这个M13引物扩出来的片段应该是多大 细菌16s
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32楼2013-05-14 10:33:22
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18761615793

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
扩增扩不出来，就是模板 引物 酶的问题 ，注意反应体系中模板的浓度，引物的合理性，酶建议使用热启动Taq酶规PCR）,片段大于15kb。使用长扩增酶
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33楼2015-03-08 21:50:13
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-超越beyond12楼
2011-03-19 16:47   回复  
引用回帖:
Originally posted by zqhao2003 at 2011-03-19 00:02:56: 楼主是用的下面这对引物吗？可以用这对引物试试，Tm 55或53都可以。 M13F(-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC M13R(-48) AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 我们一般测序都是用这对引物的，很好用，扩PCR应该没有问题。 祝 ...

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