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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 兼并引物PCR连T载体后，怎么鉴定有没有连上
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380665135

新虫 (初入文坛)

[求助] 兼并引物PCR连T载体后，怎么鉴定有没有连上

我用简并引物扩一段未知序列，扩出来后连T载体，怎么鉴定有没有连上呢，不能用简并引物去扩吧，酶切的话不知道目的序列的酶切位点情况，只能选几个试试 ，但效果都不理想啊，这一时半会也不知上哪去找通用引物，怎么办呢，急！
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1楼 2011-07-21 22:42:55
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-07-22 08:18:15
试着跑一个电泳，PCR产物是一条带，T载体也是一条带，连接成功的是另一条带，但是要求DNA较多，连接体系不至于跑了电泳就用完了。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-07-22 07:28:06
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-07-22 11:55:04
可以用引物扩增一下试试；
当然了，序列你既然都知道，何不找一个合适的酶切位点呢？酶切验证一下即可。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2011-07-22 08:25:50
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
西瓜(金币+1): 鼓励 2011-07-22 11:55:16
目的序列的酶切位点可以用软件查找的
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-07-22 08:34:49
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maggie3277

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
380665135(金币+2): 2011-07-22 09:11:17
西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-07-22 11:55:29
用T载体上的通用引物扩增下，看看pcr得到的片段大小，不就ok？
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5楼2011-07-22 08:56:27
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380665135

新虫 (初入文坛)
但是这会我没引物，合成又要过几天，有没有别的方法
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6楼2011-07-22 09:12:29
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380665135

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-22 07:28:06:
试着跑一个电泳，PCR产物是一条带，T载体也是一条带，连接成功的是另一条带，但是要求DNA较多，连接体系不至于跑了电泳就用完了。

DNA要多少呢
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7楼2011-07-22 09:14:21
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380665135

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-07-22 08:25:50:
可以用引物扩增一下试试；
当然了，序列你既然都知道，何不找一个合适的酶切位点呢？酶切验证一下即可。

我就是不知道序列呢  引物是简并的 不具有说服性吧
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8楼2011-07-22 09:15:26
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380665135

新虫 (初入文坛)
我用载体上的酶切位点把载体切开成线性，跑电泳看大小可不可以啊
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9楼2011-07-22 09:17:34
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maggie3277

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 就是这样！ 2011-07-22 11:55:57
引用回帖:
Originally posted by 380665135 at 2011-07-22 09:17:34:
我用载体上的酶切位点把载体切开成线性，跑电泳看大小可不可以啊

你之前酶切不是用的载体上的酶切位点么？应该是可以的，不过电泳的时候要把线性的未连目的片段的空载体一起电泳做个对照。
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10楼2011-07-22 09:30:27
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